Efectele hiperfibrinogenemiei asupra vasculaturii șoarecilor C57BL6 cu și fără dietă aterogenă

Din Curriculum în Genetică și Biologie Moleculară (A.A.G., S.T.L.), Departamentul de Biostatistică (C.M., T.S., G.K.) și Departamentul de Patologie și Medicină de Laborator (S.T.L.), Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill.

Vizualizați cea mai recentă versiune a acestui articol. Versiunile anterioare:

Abstract

Obiectiv- Fibrinogenul crescut este corelat cu ateroscleroza severă, așa cum este definită de apariția evenimentelor ischemice, dar baza mecanicistă a acestei corelații rămâne necunoscută. Pentru a studia această relație, am examinat ateroscleroza spontană și indusă de dietă la șoarecii transgenici cu hiperfibrinogenemie (fibrinogen crescut).

Metode și rezultate— Șoarecii normali și transgenici au fost hrăniți fie cu o dietă aterogenă, fie cu un simplu chow de crescător. Am măsurat nivelurile de fibrinogen plasmatic și am identificat o creștere a fibrinogenului în funcție de vârstă și de dietă. După 8 până la 12 luni, secțiunile aortice au fost pregătite și colorate, iar leziunile care conțin lipide au fost numărate, măsurate și evaluate pentru maturitate. Depozitele umplute cu lipide au apărut spontan într-un număr mic de șoareci de pe chow-ul crescător; leziunile tipice de tip striuri grase au apărut la aproape toate animalele hrănite cu dietă. Analiza morfometrică a arătat că nici numărul, nici mărimea leziunilor nu au fost influențate nici de nivelul fibrinogenului, nici de genotip.

Concluzii - Datele noastre au arătat că nici concentrația fibrinogenului, nici genotipul nu au avut un efect semnificativ statistic asupra inițierii, creșterii inițiale sau progresiei timpurii a leziunilor aterosclerotice.

Este bine cunoscut faptul că fibrinogenul crescut este corelat cu ateroscleroza severă, așa cum este definită de apariția evenimentelor ischemice. Primul studiu major care a raportat această corelație a fost Northwick Park Heart Study, în care, în 1980, Meade și colab. 1 au arătat o asociere semnificativă între decesul cardiovascular și concentrația de fibrinogen, care era independentă de alți factori de risc. De atunci, multe rapoarte au legat niveluri ridicate de fibrinogen cu toate formele de boli cardiovasculare (BCV). Studiile Caerphilly/Speedwell au arătat că fibrinogenul crescut este corelat cu boala cardiacă ischemică. 2 Studiul de la Göteborg a raportat că fibrinogenul este asociat cu infarct miocardic și accident vascular cerebral, boli coronariene și mortalitate totală. 3 Studiul Framingham a arătat că o varietate de BCV trebuie corelate cu fibrinogenul, inclusiv accidentul vascular cerebral, boala coronariană și boala ocluzivă arterială periferică. 4.5 Deoarece mai multe studii au coroborat aceste constatări (a se vedea revizuirea 6), nu există nicio îndoială că fibrinogenul plasmatic crescut este corelat cu BCV.

Mecanismul patologic care leagă hiperfibrinogenemia de un risc crescut de ateroscleroză evidentă din punct de vedere clinic rămâne necunoscut. O ipoteză este sugerată de efectul fibrinogenului asupra celulelor musculare netede (SMC) și celulelor endoteliale, în care fibrinogenul acționează ca o matrice provizorie pentru migrare și în care produsele de degradare a fibrinei (ogenilor) acționează ca mitogeni. 7 Aceste mecanisme sugerează că fibrinogenul crescut afectează puternic 2 dintre celulele implicate în formarea leziunii. În schimb, fibrinogenul crescut poate fi o consecință a aterosclerozei, în măsura în care fibrinogenul este o proteină în fază acută, iar nivelurile sale cresc ca răspuns la boală. Desigur, fibrinogenul crescut poate fi atât o cauză, cât și o consecință a bolii aterosclerotice.

Pentru a oferi un sistem experimental pentru a examina baza mecanicistă pentru conexiunea dintre fibrinogenul crescut și BCV, am generat șoareci transgenici cu hiperfibrinogenemie. În studiul de față, le-am folosit pentru a determina dacă nivelurile crescute de fibrinogen afectează ateroscleroza indusă de dietă la șoareci. Am ales un model indus de dietă pentru a studia inițierea și dezvoltarea timpurie a aterosclerozei, deoarece am anticipat că fibrinogenul crescut va promova patogeneza bolii. Deși leziunile induse de dietă nu progresează către plăci în stadiu târziu, leziunile cu dungi grase în aorta proximală a șoarecilor normali sunt similare cu leziunile foarte timpurii la om. 8 Leziunile din modelul nostru de șoarece au fost examinate pentru modificări de inițiere, sarcină și maturitate care au fost datorate nivelurilor de genotip sau fibrinogen.

Metode

Materiale

Produsele chimice au fost achiziționate de la Sigma Chemical Co., dacă nu se specifică altfel. Medicamentele anestezice au fost achiziționate de la Barber Veterinary Supply. Anticorpul anti-fibrinogen de iepure provenea de la Dako Corp. Materialele pentru prelevarea de sânge, secționarea și colorarea au fost de la Fisher. Chow de reproducător a fost Picolab Mouse Diet 20 (nr. 5058 iradiat) de la Purina-Mills; dieta aterogenă (TD 88051) a fost de la Harlan/Teklad.

Animale transgenice

Toate procedurile care implică șoareci au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor. Șoarecii au fost adăpostiți într-o unitate cu barieră completă în cuști sterilizate. După cum s-a descris anterior, am generat șoareci transgenici prin microinjecția locusului fibrinogenului de șoarece în ovocitele C57BL/6. 9 Transgenul a fost o clonă fagică P1 cu o inserție de 80 kb de ADN genomic de 129 SvEv, incluzând locusul fibrinogenului de 50 kb (α, β și γ) flancat de 5 și 25 kb. Șoarecii transgenici au fost identificați prin reacția în lanț a polimerazei. Am stabilit o linie de fibrinogen transgen pozitiv (FT +), în care concentrațiile plasmatice de fibrinogen au fost aproape de două ori mai mari decât la șoarecii C57BL/6 normali. Aceste animale nu au defecte de fertilitate și nici o boală trombotică și trăiesc o durată normală de viață. 9

Proiectare experimentală

Șoarecii BC au fost hrăniți cu chow de crescător până la eutanasie la 8 luni (șoareci BC8) sau 12 luni (șoareci BC12); Chow de crescător conținea nutrienți standard plus 9% grăsimi și 20% proteine. Șoarecii AD au fost hrăniți cu chow de crescător timp de 4 luni și apoi au fost hrăniți cu o dietă aterogenă până la eutanasie după 4 luni (șoareci AD4, în vârstă de 8 luni) sau 6 luni (șoareci AD6, în vârstă de 10 luni) în dietă; această dietă aterogenă, dezvoltată de Paigen și colab., 8 conținea substanțe nutritive standard plus 15,8% grăsimi, 1,25% colesterol și 0,5% colat de sodiu. Sângele a fost prelevat lunar de la toate animalele, începând cu 2 luni (șoareci BC) sau 4 luni (șoareci AD, cu 1 zi înainte de începerea dietei aterogene).

Analize plasmatice

Animalele au fost postite timp de 4 până la 6 ore și anesteziate cu ketamină/xilazină (0,31 ml/0,11 ml adus la 1 ml în ser fiziologic steril) pe baza greutății (0,1 ml/30 g). Sângele a fost extras din spațiul retro-orbital și centrifugat la 15.000 rpm timp de 15 minute, iar supernatantul plasmatic a fost depozitat la -80 ° C. Nivelurile de fibrinogen au fost determinate de ELISA. 9 Colesterolul total a fost determinat utilizând o modificare a setului de colesterol total Wako CII. Pe scurt, într-o placă cu 96 de godeuri, 100 μL de substrat cromogen/soluție enzimatică au fost amestecate cu 1 μL de probă (în duplicat). După 10 minute la 37 ° C, placa a fost citită la 550 nm. Colesterolul total în miligrame pe decilitru a fost determinat ca densitatea optică medie a probei împărțită la densitatea optică medie a standardului.