Efectele Enoant și ischemiei și reperfuziei asupra metaboliților lentilelor șobolanilor
1 Spitalul de Instruire și Cercetare din Istanbul, Clinica de Oftalmologie, Fatih, 34098 Istanbul, Turcia
2 Departamentul de Fiziologie, Facultatea de Medicină, Universitatea Yeni Yüzyıl, Topkapi, Istanbul, Turcia
3 Universitatea din Istanbul, Departamentul de Neuroștiințe, Institutul de Medicină Experimentală, Istanbul, Turcia
4 Departamentul de chimie analitică, Facultatea de Farmacie, Universitatea Bezmialem Vakif, Fatih, 34093 Istanbul, Turcia
5 Facultatea de Inginerie și Științe Naturale, Universitatea Sabancı, Tuzla, Istanbul, Turcia
Abstract
Au fost investigate efectele ischemiei și reperfuziei asupra metaboliților lentilei și efectul unui produs comercial fitoterapeutic numit „Enoant” (conținut mixt de polifenoli) asupra metaboliților lentilei selectați. În acest scop, 30 de șobolani Wistar au fost împărțiți în trei grupe în funcție de dieta lor și au fost supuși ischemiei. 10 dintre șobolani ca grupa I au fost hrăniți cu dietă uscată; celelalte 10 (grupa II) au fost hrănite cu dietă uscată și apă potabilă cu Enoant. La sfârșitul perioadei de 15 zile, ambele grupuri de șobolani au fost supuse ischemiei timp de 2 ore și reperfuzate. După alte 15 zile cu aceeași dietă, șobolanii au fost decapitați. Restul de 10 șobolani, care nu au fost supuși ischemiei (grupa III), au fost hrăniți doar cu dietă uscată. Spectroscopia 1 RMN a fost utilizată pentru determinarea metaboliților lentilei fiecărui grup de șobolani. Rezultatele obținute din cele trei grupuri au fost comparate statistic. Diferențele de metaboliți au fost semnificative, cu excepția piruvatului și succinatului. Administrarea orală a Enoant a evidențiat efecte asupra creșterii stabilizării membranei, capacității antioxidante, capacității moleculei regulatoare osmotice și conținutului de sorbitol al cristalinului perturbat de ischemie. Enoant poate fi utilizat acolo unde se formează stres oxidativ sau osmotic.
1. Introducere
Ca necesitate a vieții, aparițiile oxidative din celule determină formarea speciilor reactive de oxigen (ROS) și sunt neutralizate în cristalin prin mijloace enzimatice sau neenzimatice [1-3]. Insuficiențele din sistemele antioxidante induc producerea mai multor proteine inflamatorii care contribuie la procesul celulelor care favorizează deteriorarea lipidelor, ADN-ului, carbohidraților și proteinelor.
Metaboliții lentilei și corneei au fost studiați prin intermediul spectroscopiei prin rezonanță magnetică nucleară (RMN) încă din anii 1980. Datorită ușurinței aplicabilității lor, extractele de acid percloric au fost studiate până în ultimii ani pentru a defini metaboliții. În ultimii ani, 1 RMN a fost utilizat mai mult, în special în țesuturile tumorale, pentru a urmări efectul stimulărilor apoptotice [15-18]. Markerul cel mai frecvent studiat al deteriorării țesutului oxidativ este substanța reactivă tiobarbiturică (TBARS), iar markerul cel mai frecvent marcat în măsurarea capacității antioxidante este glutationul reductiv (GSH). Ne-am propus să cercetăm efectul asupra metaboliților lentilei cauzat de aplicarea ischemiei/reperfuziei (I/R) și efectul asupra metaboliților lentilei selectați cauzat de un produs comercial numit „Enoant”, cunoscut pentru a avea caracteristici antioxidante ridicate din cauza conținutul mixt de polifenoli și introdus ca aditiv dietetic și concentrat standardizat de extract de vin fără alcool.
2. Material și metode
2.1. Investigarea extractelor de vin concentrat
Enoant a fost furnizat cu amabilitate de Te-ha Cosmetic Company (Istanbul, Turcia). Conținutul de polifenoli din Enoant, extras din piele și semințe de struguri, a fost determinat prin cromatografie lichidă de înaltă presiune (HPLC) ca 1,47 mg/ml catehină, 0,88 mg/ml epicatechină, 130 mg/ml quercetină și 23 mg/ml resveratrol [ 19].
2.2. Investigarea lentilelor
Pregătirea animalelor a fost după cum urmează: toate studiile la animale sunt efectuate în conformitate cu directivele Comisiei Europene pentru mediu (86/609/CEE). Șobolani masculi albini Wistar (
) au cântărit 200-250 g în acest experiment. Animalele au fost găzduite 3-4 șobolani pe cuști de laborator și menținute pe un ciclu de 12 ore lumină-întuneric, cu acces ad libitum la condițiile standard de laborator timp de cel puțin 1 săptămână înainte de experiment. Zece dintre aceștia au fost numiți ca grupa I, care au fost hrăniți cu diete uscate. Ceilalți 10 șobolani (grupa II) pe lângă dieta lor au primit Enoant pe cale orală în apă proaspătă de băut (1,25 g/kg/zi) timp de 15 zile. La sfârșitul perioadei de 15 zile, carotidele bilaterale ale șobolanilor au fost legate timp de 2 ore și s-a format ischemie. Apoi, au fost refuzate la sfârșitul perioadei de 2 ore. Restul de 10 șobolani și-au continuat doar dieta uscată (Grupa III). Acești șobolani, care au ținut regimul timp de 15 zile, au fost sacrificați cu aplicarea tiopentalului peritoneal (100 mg/kg). Lentilele celor 3 șobolani din fiecare grup au fost înghețate pentru a prepara extract de acid percloric. TBARS a fost menținut la una dintre lentilele fiecăruia dintre cei 7 șobolani rămași, iar GSH reductiv a fost menținut la celelalte lentile. Spectrele 1 RMN ale celor 3 șobolani au fost preluate în extracte de acid percloric.
2.3. Pregătirea și analiza extractelor de acid percloric
Lentilele înghețate au fost pulverizate cu un mortar de porțelan și un pistil răcit cu azot lichid. Acid percloric (300 μL 10%) a fost adăugat la pulberea de țesut și pulberea a fost agitată continuu până la consistența pastei înghețate.
Proba congelată a fost imediat centrifugată la 3000 g timp de 10 minute la temperatura camerei. Supernatantul a fost neutralizat cu hidroxid de potasiu 0,1 M la valori de pH de 7,0-7,2. Proba a fost apoi centrifugată la 3000 g timp de 10 minute la temperatura camerei și supernatantul final a fost colectat [20].
Supernatanții preparați au fost uscați sub vid și au fost rezolvați în 0,3 ml oxid de deuteriu (D20). Spectrele 1 RMN au fost obținute cu un spectrometru Varian Unity Inova 500 (11,7 T) care funcționează la 500 MHz pentru protoni.
În plus, un număr mare de vârfuri suprapuse care aparțin glucozei, fructozei și sorbitolului în spațiul cuprins între 3,00 și 5,00 ppm. De aceea, tripletul din spațiul dintre 3,71 și 3,74 ppm pentru sorbitol a fost luat ca referință. În plus, în literatura de specialitate, sa raportat că tripletul 3.73 a crescut în lipsa sorbitol dehidrogenazei [31]. Integralele relative ale vârfurilor de referință ale metaboliților selectați în spațiul cuprins între 0,5 și 5,00 ppm au fost luate luând în considerare apa, deoarece apa a fost introdusă fix în preparatul 1 RMN din grupele I, II și III. Și rezultatele integrale relative medii dintre fiecare 3 grupuri au fost comparate statistic.
2.4. Măsurarea nivelurilor de lentile GSH
S-a adăugat o soluție de deproteinază (120 g NaCI, 6,68 g acid m-fosforic și 0,8 g EDTA) la omogenizat tisular 10% al cristalinului. Proteinele precipitate au fost îndepărtate prin centrifugare. La supernatant s-au adăugat fosfat disodic 0,6 M și acid 5,5'-ditio-bis-2-nitrobenzoic (DTNB), iar probele au fost măsurate la 412 nm în 5 minute. Rezultatele au fost exprimate ca μmoL/g țesut [32].
2.5. Măsurarea nivelurilor de lentile TBARS
10% omogenizat de lentile au fost preparate cu 0,15 M KCL. 50 μL 8,1% dodecil sulfat de sodiu, 50 μAcid acetic L (ajustat la pH 3,5) și 100 μReactivii acidului tiobarbituric (TBA) au fost adăugați la 50 μL se omogenizează. Amestecul de reacție a fost menținut într-o baie de apă clocotită timp de 45 de minute. După răcire la temperatura camerei, TBA a fost extrasă cu n-butanol/piridină (15: 1). Probele au fost măsurate la 535 nm. Rezultatele au fost calculate ca țesut nmoL/g [33].