Efectele conținutului de acizi grași din dietă asupra cartilajului humeral și a structurii osoase la un model de șoarece
Lauren Votava
1 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110
2 spitale Shriners pentru copii - St. Louis, St. Louis MO 63110
3 Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110
Andrea G. Schwartz
1 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110
2 spitale Shriners pentru copii - St. Louis, St. Louis MO 63110
Natalia S. Harasymowicz
1 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110
2 spitale Shriners pentru copii - St. Louis, St. Louis MO 63110
Chia-Lung Wu
1 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110
2 spitale Shriners pentru copii - St. Louis, St. Louis MO 63110
Farshid Guilak
1 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110
2 spitale Shriners pentru copii - St. Louis, St. Louis MO 63110
3 Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110
Contribuțiile autorului: LV și FG au dezvoltat conceptul și au conceput experimente. LV a efectuat experimente. LV, AGS, NSH și CLW au analizat datele. LV a scris manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final trimis.
Abstract
INTRODUCERE
Pentru a studia mai direct mecanismele care leagă obezitatea și OA, au fost dezvoltate modele animale de obezitate folosind fie o dietă bogată în grăsimi 10-14, fie ablația genetică a semnalizării leptinei (de exemplu, șoareci ob/ob sau db/db). 15 Studii multiple au arătat o severitate crescută a OA spontană 15-17 sau OA indusă de leziuni 7,13,14 la animale hrănite cu o dietă bogată în grăsimi, dar lipsa OA spontană la șoarecii obezi cu deficit de leptină hrăniți cu o dietă standard chow . 15
Există, de asemenea, dovezi în creștere că compoziția dietetică în sine poate contribui la OA indusă de obezitate. În plus față de conținutul caloric, există dovezi din ce în ce mai mari că compoziția dietei, în special conținutul de acizi grași, poate avea efecte semnificative asupra severității OA într-o manieră specifică articulațiilor. 7,10,18,19 De exemplu, dietele bogate în grăsimi compuse în principal din acizi grași saturați (SFA) sau acizi grași polinesaturați ω-6 (PUFA) prezintă OA la genunchi indus de leziuni considerabil mai slabe decât omologii cu greutate ridicată dietă grasă cu FA-3 PUFA sau o dietă standard pentru șoareci. 10 Aceste studii au observat că o dietă bogată în grăsimi suplimentată în FA-3 PUFA protejează genunchiul de OA indusă de leziuni, în timp ce dietele bogate în grăsimi bogate în grăsimi saturate și ω-6 PUFA exacerbează degenerarea cartilajului și sinovita după leziuni la genunchi. Cu toate acestea, nu s-a observat nici un efect semnificativ al creșterii PUFA ω-3 dietetice asupra dezvoltării OA spontană în articulația genunchiului. 7,10,20
Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă conținutul de acizi grași din dietă a influențat apariția modificărilor structurale spontane ale OA și ale oaselor la șoarecii obezi cu conținut ridicat de grăsimi. Șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă chow de control cu conținut scăzut de grăsimi, fie cu diete bogate în grăsimi bogate în FA-3 PUFA, ω-6 PUFA sau SFA. Am emis ipoteza că dieta bogată în FA-3 PUFA ar avea un efect protector asupra cartilajului și a oaselor. Osul, cartilajul și sinoviul capetelor humerale au fost analizate pentru modificări asociate OA folosind tomografia micro-computerizată (MicroCT) pentru a examina microstructura osoasă, microscopia cu forță atomică (AFM) pentru a examina proprietățile mecanice ale cartilajului la scară mică și clasificarea histologică la evaluați degenerarea cartilajului și inflamația sinovială.
METODE
Model animal.
Începând cu vârsta de 4 săptămâni, șoarecii masculi C57BL/6J au fost hrăniți timp de 24 de săptămâni fie cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (10% kcal), fie una dintre cele trei diete bogate în grăsimi (60% kcal) bogate în FA-3 PUFA, ω-6 PUFA sau SFA . Acești șoareci au fost inițial dezvoltați pentru un studiu anterior care investiga modul în care acizii grași din dietă afectează dezvoltarea OA a genunchiului și au fost raportate date privind conținutul dietetic, greutățile corporale, severitatea OA a genunchiului, măsurarea citokinelor și lipidelor serice și răspunsul la vindecarea rănilor urechii. 7.10 Astfel, nu au fost utilizate animale vii în prezentul studiu, dar toate procedurile anterioare de utilizare a animalelor au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor. 7.10 Toate eșantioanele au fost depozitate la -20˚C după eutanasie. Înainte de analiză, exemplarele au fost decongelate la 4 ° C, iar capetele humerale au fost izolate.
Analiza MicroCT a osului trabecular și cortical.
Capetele humerale au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 24 de ore la temperatura camerei (n = 12-15 per grup de dietă). Eșantioanele au fost apoi deshidratate în etanol și scanate în aer cu MicroCT (SkyScan 1176, Bruker, Billerica, MA) la o rezoluție de 9 μm/pixel, o tensiune de raze X de 55 kV, curent 455 μA, timp de expunere 980 ms, 3x cadru mediu, și filtrarea fasciculului cu filtru de aluminiu de 0,5 mm. Densitatea minerală osoasă a fost calibrată utilizând fantome de hidroxiapatită (Bruker). Regiunile trabeculare ale capului humeral au fost definite ca volumul dintre placa osoasă subcondrală și placa proximală de creștere. Fiecare regiune a fost analizată folosind extensia BoneJ în ImageJ. S-au calculat fracțiunea volumului osului trabecular (BV/TV), grosimea trabeculară (Tb.Th.) și separarea trabeculară (Tb.Sp.). Regiunile osoase corticale au fost analizate folosind pachetul software CTan automat (Bruker). Aria și grosimea secțiunii transversale a osului cortical au fost calculate din 20 de felii situate la două regiuni diafizare: 0,5 mm de aspectul distal al capului humeral și la aspectul distal al tuberozității deltoide (n = 6-14).
Microscopia forței atomice.
Testarea mecanică a proprietăților microscale ale cartilajului a fost efectuată cu un AFM așa cum sa descris anterior. 28.30 Pe scurt, capetele humerale proaspăt disecate au fost încorporate într-un mediu de temperatură optimă de tăiere (OCT) și s-au obținut criosecții groase de 5 μm ale cartilajului articular al capului humeral. Secțiunile au fost scurt decongelate și colorate imunologic pentru colagen VI ca marker al PCM. Pe scurt, secțiunile au fost spălate în PBS, blocate în ser de capră normal 10% și incubate cu anticorpi de colagen policlonal tip VI de afinitate purificat (Fitzgerald Industries, Acton, MA) diluate 1: 200 în soluție de blocare timp de 1 oră. Secțiunile au fost clătite cu PBS și colorate cu AlexaFluor 488 anticorp conjugat de capră anti-iepure diluat la 1: 200 în soluție de blocare (Abcam, Cambridge, MA). Secțiunile au fost menținute în PBS până la analiză pentru a păstra hidratarea. Modulul mecanic local a fost calculat folosind un AFM (MFP-3D, Asylum Research, Santa Barbara, CA). Țesutul cartilajului a fost sondat folosind un consolă de siliciu (k
5,4 N/m 2; Novascan Technologies, Ames, IA) cu un indenter sferic borosilicat de 5 μm diametru care a fost calibrat zilnic. Regiunile de interes care înglobează un singur condrocit au fost identificate folosind microscopia cu fluorescență și situate la aproximativ 1-2 celule distanță de marginile exterioare ale secțiunilor pentru a evita artefactele de margine rămânând în afara cartilajului zonei profunde și a osului subcondral. Regiunea de analiză AFM a fost de 10 μm 2 și s-a efectuat o indentare la fiecare 0,5 μm pentru a da un număr total de 400 de indentări pe regiune. Eșantionul a fost indentat la o rată de 10 μm/s, deoarece studiile anterioare au arătat o variație mică sau deloc a valorilor modulului pentru viteze de indentare între 5 și 25 μm/s. 31 Indentarea a fost continuată până la atingerea forței de declanșare, 300 nN.