Efectele compoziției dietei asupra grăsimii corporale și steatozei hepatice la un animal (Peromyscus

Lisa Krugner-Higby

1 Centrul de resurse pentru animale de cercetare și

Stephen Caldwell

3 Universitatea din Virginia Departamentul de Medicină, Charlottesville, și

Kathryn Coyle

5 Biroul Provost, Universitatea din Kentucky, Lexington, Kentucky; și

Eugene Bush

6 Abbott Global Pharmaceutical Research, Abbott Park, Illinois

Richard Atkinson

4 Obetech, Richmond, Virginia;

Valerie Joers

2 Wisconsin National Primate Research Center, Universitatea din Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin;

Abstract

Materiale și metode

Animale.

Proiectare experimentală. Dieta 12%, dieta saraca in grasimi; Dieta 26%, dieta moderata cu grasimi; 45% dietă, dietă bogată în grăsimi.

Determinarea trigliceridelor serice.

Sângele a fost obținut prin cardiocenteză de la șoareci anesteziați cu pentobarbital, pus pe gheață și centrifugat pentru a colecta serul, care a fost apoi înghețat la -70 ° C până la testare. Probele pentru analiza trigliceridelor au fost obținute numai de la șoareci neînțepați. Un kit de testare comercială a fost utilizat pentru măsurarea trigliceridelor serice (catalog TR0100-1KT, Sigma Aldrich, St Louis, MO).

Măsurarea compoziției corpului.

Anestezia la șoarecii din California a fost indusă de izofluran gaz într-un recipient închis și menținută utilizând gaz izofluran furnizat de conul nasului. Șoarecii au fost așezați pe densitometru (Lunar PIXImus, GE Healthcare, Piscataway, NJ) pentru scanare (versiunea software 1.42.006.010, GE Healthcare). Scanările au durat aproximativ 15 min. Compoziția corpului a fost făcută utilizând un scaner de densitometrie care a fost validat pentru utilizare la șoareci de laborator. 25

Măsurarea terminală a compoziției corpului.

La necropsie, conținutul intestinal al carcaselor de șoarece a fost îndepărtat și apoi restul carcasei a fost înghețat la -20 ° C. Carcasele au fost autoclavizate la 250 ° C timp de 6 ore în pahare mari, acoperite. Materialul rezultat a fost omogenizat folosind un omogenizator cu foraj mare (PT 6000, Brinkman Instruments, Westbury, NY). Probele au fost cântărite înainte și după autoclavare. Grăsimea a fost extrasă în metanol: cloroform și apoi carcasele au fost uscate într-un cuptor sub vid la 60 ° C timp de 48 de ore. Probele triplicate au fost transformate în cenușă pentru determinarea conținutului de minerale. 4

Distribuția grăsimii corporale la șoarecii din California.

Șoarecii HR și LR au fost hrăniți fie cu dieta de 26%, fie cu cea de 12%, timp de 18 săptămâni. La necropsie, ficatul a fost punctat in situ pentru evidența grosieră a lipidozei hepatice, inclusiv extinderea ficatului dincolo de joncțiunea costocondrală, paloarea și modelul reticular. Scorul nu a fost efectuat orb la starea de tratament, dar scorurile brute au fost doar o măsură a steatozei hepatice utilizate în aceste studii. Ficatele au fost îndepărtate și cântărite la necropsie. Tampoanele de grăsime intraabdominale, gonadale, subscapulare și inghinale au fost îndepărtate și cântărite.

Histopatologie.

Șoarecii din California au fost eutanasiați utilizând pentobarbital (mai mare de 120 mg/kg IP). Probele de sânge au fost colectate terminal prin cardiocenteză, iar lobii hepatici drept și stâng au fost disecați liberi și fixați în formalină tamponată neutră 10% pentru evaluare histopatologică. Secțiunile fixate pe formalin au fost colorate cu hematoxilină și eozină și punctate utilizând un sistem de notare detaliat. 22 de secțiuni în serie au fost colorate cu tricrom Masson pentru a cuantifica mai bine depunerea de colagen asociată cu fibroza. Secțiunile hepatice reprezentative au fost colorate cu roșu ulei O pentru a vizualiza lipidele hepatice. Diapozitivele au fost codificate și punctate în conformitate cu criteriile standard 7.22 pentru steatoză, apoptoză, inflamație și fibroză de către un patolog veterinar îmbarcat (KC), care era orb la starea de tratament.

Concentrația de leptină în circulație.

Probele de sânge au fost obținute prin sângerare retroorbitală sau cardiocenteză de la șoareci sub anestezie pentobarbitală profundă în momentul necropsiei. Serul a fost separat de elementele celulare prin centrifugare. Serul a fost îndepărtat, plasat într-un tub proaspăt și congelat la -70 ° C până la testare. Concentrația serică de leptină a fost testată folosind kituri comerciale (Murine Leptin ELISA, Crystal Chem, Downers Grove, IL).

Rezultatele experimentelor inițiale de cuantificare și caracterizare a cantității și distribuției de grăsimi la șoarecii din California au indicat că fenotipul steatozei hepatice observat în experimentele anterioare ar putea deveni mai extrem și se poate manifesta mai rapid dacă dieta conține mai multe grăsimi. Experimentele folosind dieta de 45% s-au concentrat pe steatoza hepatică, deoarece grăsimea este depozitată în ficatul șoarecilor. Grupuri de șoareci HR și LR (n = 8) au fost hrăniți cu 45% dietă timp de 6 săptămâni. Șoarecii au fost eutanasiați, iar ficatul a fost colectat, cântărit și fixat în 10% formalină tamponată neutră. Secțiunile colorate cu hematoxilină și eozină au fost evaluate pentru steatoză și inflamație așa cum s-a descris anterior. 22 de grupuri suplimentare de 4 șoareci LR au fost hrăniți fie cu dieta de 12%, fie cu cea de 45%, timp de 6 săptămâni. Șoarecii au fost eutanasiați, iar probele de ficat au fost congelate la -80 ° C. Ficatele au fost extrase și testate pentru conținutul de lipide, proteine și cenușă, așa cum este descris mai jos.

Analiza compoziției hepatice.

probe umede de ficat (1 g) au fost analizate pentru compoziții relative de lipide, proteine și cenușă. Greutatea ficatului uscat a fost determinată prin liofilizarea probelor de ficat umed timp de 72 de ore. Porțiunile lipidice ale probelor de ficat uscate au fost separate de proteină și cenușă. 16 Fracțiile lipidice colectate au fost uscate sub centrifugare sub vid și cântărite pentru a determina greutatea lipidică a probelor de ficat uscate. Greutatea fracției de proteine și cenușă a probelor de ficat uscat a fost determinată prin scăderea greutăților fracțiunii lipidice din greutățile totale ale ficatului uscat. Rezultatele au fost exprimate pe gram de ficat uscat.

Analiza datelor și statisticile.

ANOVA, testele Student t și analiza corelației au fost efectuate pe date parametrice utilizând software-ul Excel (Microsoft, Redmond, WA). Testele neparametrice, incluzând corelația ordinii rangului Spearman cu covarianța, testul Mann-Whitney și testul Kruskal-Wallis au fost efectuate utilizând software-ul SPSS (SPSS Institute, Cary, NC). Raporturile de cote au fost calculate utilizând Epi Info (Centers for Disease Control, Atlanta, GA). Semnificația a fost dedusă la un nivel α mai mic sau egal cu 0,05. Datele sunt date ca medie ± SE.

Rezultate

Analiza antemortem și postmortem a grăsimii corporale.

Scanările DEXA ale șoarecilor adulți din California au indicat că șoarecii hrăniți cu dieta moderată (26%) cu grăsimi dobândesc grăsimi corporale suplimentare pe măsură ce îmbătrânesc. Șoarecii din California scanați la vârsta de 1 an au avut semnificativ (P Figura 2 A), cu 3 săptămâni înainte ca șoarecii să fie eutanasiați pentru analiza terminală a grăsimii corporale. Un grup de control al șoarecilor californieni cu vârsta potrivită (cu vârsta mai mare de 1 an) care au alimentat o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (12%) au fost scanate în același timp. Șoarecii din California hrăniți cu dieta de 26% au avut semnificativ (P Figura 2 B). Nu au existat diferențe semnificative între șoareci de sex masculin și femele la fiecare moment (1 sau 1,5 ani) sau în funcție de dietă. La trei săptămâni după ultima scanare DEXA, ambele grupuri de dietă de 12% și 26% au fost eutanasiate. Evaluări terminale ale grăsimii corporale prin metanol: extracția cloroformului a validat rezultatele scanărilor DEXA, prin aceea că șoarecii hrăniți cu dieta de 12% au avut o semnificativă (P Figura 3). Similar cu rezultatele obținute prin utilizarea scanării DEXA, nu a existat nicio diferență semnificativă între șoarecii masculi și femele în ceea ce privește grăsimea corporală post-mortem. Analiza de corelație care compară rezultatele analizelor de grăsime corporală ante și postmortem a indicat o corelație mult mai mare între rezultatele analizei grăsimii corporale efectuate prin scanarea DEXA antemortem și analiza chimică a grăsimii corporale postmortem la șoarecii care au alimentat dieta de 12% (r = 0,76) decât pentru șoarecii hrăniți cu dieta de 26% (r = 0,57). Prin urmare, șoarecii hrăniți cu dieta de 26% păreau să aibă depozite de grăsimi care au fost slab evaluate prin scanare DEXA și care nu erau prezenți la șoarecii hrăniți cu dieta de 12%.