Drenajul ganglionar limfatic compartimentat dictează răspunsuri imune adaptive intestinale bioRxiv
Abstract
Funcția principală a intestinului este de a digera și absorbi substanțele nutritive din dietă, cu ajutorul epiteliului absorbant și al sistemului vasculator și limfatic subiacent, precum și al microbiomului 6. Selecția nutrienților și modificarea capacității de absorbție de-a lungul intestinului; majoritatea nutrienților din dietă sunt absorbiți în vilozitățile intestinului subțire superior (duoden (D) și jejun (J)) și într-o măsură mai mică de intestinul subțire inferior (ileon, I), în timp ce microbiota densă din I și colon C ) mediază eliberarea suplimentară de nutrienți. Intestinul găzduiește, de asemenea, cel mai mare compartiment imunitar din organism, însărcinat să ofere rezistență la toxine și să invadeze agenții patogeni, menținând în același timp toleranța la antigenele dietetice și microbiote, fie prin acțiune locală, fie prin trafic limfatic către intestin - drenând mLN-uri pentru a monta răspunsuri adaptive 1.7, 9 . Am căutat să înțelegem cum drenajul limfatic compartimentat al intestinului contribuie la un răspuns imun organizat în acest mediu complex.
Datele noastre descoperă un mecanism prin care sistemul imunitar intestinal tratează simultan răspunsurile de reglementare versus cele proinflamatorii: prin segregarea anatomică a acestor reacții în mLN-uri diferite, funcțional specializate. Drenajul eficient al antigenelor dietetice în toleranță - promovând ganglionii limfatici asociați cu intestinul proximal contribuie la înțelegerea prevenirii alergiilor alimentare și implică infecția duodenală și disbioza ca perturbări ale mediului care pot modifica rezultatul alergic. Este plauzibil ca vaccinarea orală să genereze în general răspunsuri imune diminuate 30 prin același mecanism. Cu toate acestea, calea duodenală tolerogenă ar putea fi exploatată terapeutic pentru inducerea toleranței la surse de antigen inflamatorii pro-inflamatorii altfel inaccesibile, cum ar fi bacteriile ileale disbiotice sau colonice în bolile inflamatorii intestinale.
Metode
Șobolani femele Wistar de 6-10 săptămâni au fost cumpărate de la Charles River. Îngrijirea și experimentarea animalelor au fost în concordanță cu orientările NIH și au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Rockefeller.
Reactivi
Următorii reactivi au fost cumpărați de la Sigma: Benzil eter (108014), diclorometan (270997), Fast Green FCF (F7252), Heparin (H3393), Omeprazol (O104), Pluronic L-81 (435430), Pyrantel Pamoate (P6210), Ovalbumina (gradul VI, A2512; gradul III A5378) și Vancomicina (V2002). Ovalbumină fără LPS provenea din Hyglos, Germania (nr. Cat. 77161). 3 H –retinol și Na 125 I provin din Perkin-Elmer.
Anticorpi, colorare și citometrie în flux
Îndepărtarea țesuturilor, microscopia cu foi luminoase și reconstrucția imaginii
Pentru curățarea și colorarea țesuturilor, protocolul iDISCO a fost urmat așa cum este detaliat pe site-ul web actualizat continuu: http://idisco.info cu următoarele specificități: Țesuturile au fost colorate în anticorpi primari și secundari timp de 4 zile fiecare și au fost încorporate în 1 % agaroză-TAE înainte de deshidratarea finală. Blocurile au fost realizate cu ajutorul unui ultramicroscop LaVision II și a unui software. Imaginile au fost reconstruite folosind software-ul Imaris 8.
Biodistribuirea 3H-retinolului
Șoarecii au fost postiti timp de 3h înainte de gavaj cu 150 Pl PBS cu sau fără 5 pl de formare de chilomicron care inhibă Pluronic L-81, urmat de 1 µCi 3 H-retinol în 100 pl de ulei de măsline 30 minute mai târziu, și eșantionat la momentele indicate. Serul a fost prelevat din vena submandibulară (sistemică) sau din vena portă. Limfa a fost colectată din conducta toracică sub anestezie cu izofluran utilizând un ac de sticlă personalizat (dispozitiv de extragere a micropipetelor, instrument Sutter). Organele disecate au fost cântărite înainte de liză prin întreruperea mecanică în 0,5 ml tampon de liză hipertonică cu 1% Triton-X 100, lizatul amestecat cu 7 ml cocktail de scintilație Ultima Gold (Perkin Elmer) și acumularea de radioactivitate măsurată pe un contor de scintilație. Radioactivitatea de intrare a fost estimată prin numărarea a 10% din materialul gavat.
Segmentarea ganglionilor limfatici mezenterici
Ganglionii limfatici mezenterici care drenează segmentele intestinale au fost determinați anatomic prin urmărirea vaselor limfatice care leagă colonul, ileonul și jejunul de ganglionii lor limfatici. Ganglionii limfatici duodenali au fost dezvăluiți prin extragerea a 100 ofl de ulei de măsline (Sigma) și determinarea ganglionilor limfatici cei mai apropiați de stomac înconjurați de chyle, indicativ de drenaj duodenal, la 1h după gavaj.
Izolarea limfocitelor și APC de ganglioni limfatici
Țesuturile au fost disecate în HBSS rece, suplimentate cu Mg 2+ și Ca 2+, tocate mărunt și incubate în 400 U/ml colagenază D (Roche) în HBSS timp de 25 min la 37 ° C, 5% CO2. Colagenaza a fost stinsă pe gheață prin adăugarea de FCS final de 10%. Suspensiile cu o singură celulă au fost extrase din țesutul conjunctiv prin preluarea și resuspendarea digestelor de cinci ori. Eritrocitele au fost lizate prin incubare în tampon de liză eritrocitară (Sigma) timp de 7 minute la RT.
Izolarea limfocitelor și a APC din intestinul subțire și gros
Izolarea celulelor pentru ARN-seq
Celulele au fost sortate folosind un citometru de flux de sortare a celulelor FACS Aria (Becton Dickinson). Celulele dendritice MLN au fost pre-îmbogățite folosind un kit de izolare a celulelor pan dendritice (130-100-875, Miltenyi Biotec) și coloane de separare LS MACS (Miltenyi Biotec). Bărbații C57BL/6 în vârstă de 14 săptămâni au servit ca donatori mLN și s-au colectat triplicate biologice sau cvadruplicate. Celulele dendritice au fost sortate ca Aqua - CD45 + Lin - (CD3 - B220 - NK1.1 - CD19 -) CD11c hi, iar subpopulațiile în continuare ca MHCII hi CD103 + CD11b - și MHCII hi CD103 + CD11b +. Trei sute de celule au fost sortate direct în 25 μl tampon TCL (Qiagen, 1031576) suplimentat cu 1% β-mercaptoetanol la o singură celulă de precizie. Probele au fost ținute la temperatura camerei timp de 5 minute, rotite și ținute la -80 °C până la prelucrarea ulterioară.