Dieta cu polen influențează producția și exprimarea peptidelor antimicrobiene în

Jiří Danihlík

1 Departamentul de Biochimie și Proteomică a Proteinelor, Centrul Regiunii Haná pentru Cercetări Biotehnologice și Agricole, Facultatea de Științe, Universitatea Palacký din Olomouc, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Republica Cehă; [email protected] (J.D.); [email protected] (R.L.); [email protected] (M.Š.)

2 Departamentul de Biochimie, Facultatea de Științe, Universitatea Palacký din Olomouc, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Republica Cehă; [email protected]

Mária Škrabišová

3 Departamentul de Biologie Moleculară, Centrul Regiunii Haná pentru Cercetări Biotehnologice și Agricole, Facultatea de Științe, Universitatea Palacký din Olomouc, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Republica Cehă; [email protected]

René Lenobel

Marek Šebela

Eslam Omar

4 Institutul de Biologie, Universitatea din Graz, Universitätsplatz 2, 8010 Graz, Austria; ge.ude.nua@ramomalse (E.O.); [email protected] (K.C.)

Marek Petřivalský

2 Departamentul de Biochimie, Facultatea de Științe, Universitatea Palacký din Olomouc, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Republica Cehă; [email protected]

Karl Crailsheim

4 Institutul de Biologie, Universitatea din Graz, Universitätsplatz 2, 8010 Graz, Austria; ge.ude.nua@ramomalse (E.O.); [email protected] (K.C.)

Robert Brodschneider

4 Institutul de Biologie, Universitatea din Graz, Universitätsplatz 2, 8010 Graz, Austria; ge.ude.nua@ramomalse (E.O.); [email protected] (K.C.)

Date asociate

Abstract

1. Introducere

Lipsa nutrienților importanți în dieta albinelor poate duce la o reducere a numărului de larve sau la o vitalitate slăbită a adulților din coloniile de albine de miere [1]. Cei mai necesari nutrienți sunt zaharurile, proteinele și lipidele conținute în nectar și polen. Albinele adulte necesită o dietă adecvată și echilibrată pe parcursul vieții lor, deoarece se confruntă cu sarcini și provocări variabile. Calitatea nutrițională a polenului diferă între speciile de plante, cu o variabilitate semnificativă a conținutului total de proteine, lipide, zaharuri și aminoacizi, precum și a capacității antioxidante [2]. Aportul mediu de polen pe albină este de 3,4–4,3 mg/zi, cea mai mare cantitate de polen fiind consumată de albinele alăptătoare [3]. Pe lângă sursele de dietă naturală colectate de albine în timpul sezonului (nectar, mierat, polen), se știe că diferite diete cu carbohidrați care sunt hrănite coloniilor ca hrană de iarnă provoacă expresii diferențiale ale diferitelor gene din corpurile de grăsime ale albinelor [4].

Insectele sociale, în general, posedă un număr mai mic de gene legate de imunitate în comparație cu insectele solitare [5,6]. Există trei niveluri de imunitate a albinelor care se reflectă în interacțiunile lor cu agenții patogeni - bariere fizice, imunitate celulară și imunitate umorală și, în plus, albinele ca insecte sociale au dezvoltat un tip special de imunitate - imunitatea socială [7,8]. Aportul nutrițional al albinelor de miere și eficacitatea răspunsurilor imune individuale apar într-o posibilă relație reciprocă [9]. Partea umorală a imunității albinelor lucrătoare constă din enzime, lectine și peptide antimicrobiene (AMP). Gätschenberger și colab. [10] a arătat că puterea imunitară generală a albinelor de vară și de iarnă a rămas la același nivel. Cu toate acestea, atunci când albinele sunt extrem de infectate cu virusul aripii deformat, genele imunității celulare sunt reglate în jos, în timp ce expresia genelor imune umorale crește [11]. Condițiile de stres, induse de expunerea la doze subletale de neonicotinoizi, compromit și imunocompetența individuală a albinelor [12].

Lucrarea de cercetare publicată care se ocupă de schimbările în expresia genelor pentru AMP-urile de albine de miere ca răspuns la stimuli specifici s-a bazat în principal pe analize PCR cantitative ale țesuturilor albinelor sau ale corpurilor întregi [21,22,23]. În plus, alte câteva metode, cum ar fi electroforeza pe gel de poliacrilamidă, cromatografia lichidă de înaltă performanță și spectrometria de masă au fost utilizate pentru detectarea și cuantificarea peptidelor antimicrobiene în probe combinate de un număr mare de albine [14,24,25]. Studiile asupra AMP-urilor pentru albine se referă în principal la modificări în expresia genelor corespunzătoare, deoarece până acum au fost publicate doar câteva rapoarte privind cuantificarea nivelurilor de peptide AMP. O metodă analitică nouă și extrem de sensibilă a fost recent dezvoltată pentru cuantificarea izoformelor apidaecinei 1 în hemolimfa sau părțile corpului fiecărei albine individuale, care este considerată a fi un instrument promițător pentru cuantificarea exactă a AMP-urilor pentru albine [26].

Aici, am investigat modificările parametrilor selectați ai sistemului imunitar umoral la albinele individuale cărora li s-au administrat diferite diete de polen. Am analizat expresia relativă a genelor care codifică apidaecinele și abaecina în abdomenele albinelor, unde sunt sintetizate în corpurile grase. De asemenea, raportăm prima măsurare cantitativă a nivelurilor izoformelor active ale apidaecinei 1 în toracele albinelor, unde sunt prezente în hemolimfa circulantă, la nivelul individual al albinelor menținute in vitro.

2. Materiale și metode

2.1. Produse chimice

Standardele sintetice ale apidaecinei 1A și izotopic [13 C6 15 N4] marcate cu apidaecina 1A (la capătul C-terminal) au fost sintetizate de Clonestar (Brno, Republica Cehă). Ambele standarde peptidice sintetice în soluții au fost cuantificate prin analiza aminoacizilor de către Protein Analysis Group, Functional Genomics Center, Swiss Federal Institute of Technology, Zurich, Elveția. Acetonitril, metanol, apă (toate de calitate LC/MS), 98% (v/v) acid formic și acid trifluoroacetic p.a. au fost de la Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania). 2-propanolul pentru spectroscopie a fost de la Merck (Darmstadt, Germania). Toate substanțele chimice utilizate în cuantificarea expresiei genelor au fost achiziționate în calitate de biologie moleculară.

2.2. Creșterea și hrănirea albinelor

Am incubat faguri de puiet sigilați din mai multe colonii de Apis mellifera carnica de la Institutul de Zoologie, Graz, la 34,5 ° C în condiții standard pentru a obține lucrători de albine nou-născuți, cu vârsta mai mică de 24 de ore [27]. Albinele au fost alese la întâmplare și amestecate înainte de a fi introduse în cuști experimentale formate din cupe din plastic transparent. Cuștile au fost, de asemenea, furnizate cu o bară de ceară și experimentele au fost menținute timp de 18 zile. Fiecare cușcă conținea 100 de albine și experimentul a fost realizat în cuști duplicate pentru fiecare tip de dietă.

2.3. Pregătirea dietelor de polen și a factorilor nutriționali

Toate albinele au primit o soluție de zaharoză 50% (g/v) ad libitum. Toate cuștile, cu excepția uneia, au fost hrănite suplimentar cu una dintre următoarele diete proteice: Feedbee TM, o dietă suplimentară proteică disponibilă pe piață, care nu conține niciun produs de stup [28], sau polen corbicular conținând 94,8% din floarea-soarelui (Helianthus spp.), 91,2% mustar (Sinapis spp.), 70,6% sparanghel (Asparagus spp.) sau 87,6% castan (Castanea sativa). Vezi Omar și colab. [29] pentru mai multe detalii despre diete. Polenul monofloral a fost colectat de albine în Austria și ținut congelat până la utilizare. Grupul mixt de polen a primit un amestec de 25% (greutate/greutate) din fiecare dintre cele patru tipuri diferite de polen. Fiecare încărcare de polen a fost analizată palinologic la AGES - SPB, Abteilung, Bienenkunde und Bienenschutz, Lunz am See, Austria și frământată într-un aluat care a fost furnizat albinelor în cuști într-o jumătate de tuburi cilindrice de plastic de 10 ml [27]. Toate dietele de albine au fost reînnoite și ponderate zilnic. Consumul mediu cumulativ de diete în timpul celor 18 zile de hrănire a variat de la 42,52 mg/albină pentru sparanghel până la 68,28 mg/albină pentru dieta mixtă cu polen (a se vedea Materialul suplimentar S1).