Dieta bogată în grăsimi plus colesterol ridicat duce la steatoză hepatică în larvele de pește zebră, un model nou pentru
Abstract
fundal
Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD), caracterizată ca acumulare excesivă de lipide în hepatocite, crește în prevalență. Exploatarea medicamentelor eficiente pentru NAFLD sa dovedit a fi o provocare. Aici, ne-am propus să stabilim un model dietetic de steatoză hepatică folosind larve transparente de pește zebră în care să poată fi efectuate ecrane chimice cu randament ridicat.
Metode
Larvele de pește zebră hrănite cu dietă bogată în grăsimi (HF) și dietă bogată în grăsimi plus colesterol ridicat (HFC) au fost comparate cu martorul. Am analizat acumularea de lipide intrahepatice, indicii biologici și diverse căi, inclusiv metabolismul lipidic, stresul ER și inflamația. În plus, au fost evaluate efectele ezetimibului și simvastatinei asupra steatozei induse de dieta HFC.
Rezultate
Concluzie
Rezultatele noastre demonstrează că modelul de steatoză a larvelor de pește zebră stabilit și validat în acest studiu ar putea fi utilizat in vivo studii de steatoză și screening pentru medicamente.
Introducere
Boala ficatului gras nealcoolic (NAFLD) este cea mai frecventă cauză a disfuncției ficatului uman și prezintă un risc enorm pentru sănătatea umană [1]. Se estimează că aproximativ 20% -30% din populația generală suferă de steatoză simplă, iar prevalența steatohepatitei nealcoolice (NASH) este de 3% -10% [2]. Blocarea steatozei hepatice este crucială pentru prevenirea dezvoltării NAFLD. Deși s-au înregistrat îmbunătățiri în progresia steatozei hepatice către inflamația hepatică mai avansată din cauza modificărilor stilului de viață și a utilizării suplimentelor [3, 4], patogeneza NAFLD rămâne neclară, iar medicamentele terapeutice sunt încă restricționate.
Metode
Îngrijirea și hrănirea peștilor zebră
Embrionii cu pete AB de tip sălbatic au fost menținuți conform protocolului standard [32]. Larvele de pește zebră au fost hrănite cu dietă de control (Zeigler Bros, Inc., SUA. Proteine: 50%, grăsimi: 12%, fibre: 2,5%), dietă HF (Marine Biological Science Co., LTD din CNSIC, Tianjin, China. Proteine: 50%, Grăsimi: 24%, Fibre: 2,5%) și dieta HFC (2,5% și 5,0% greutate/greutate colesterol adăugat la dieta HF așa cum este descris [33]). Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea de Medicină din Sud, Guangzhou și s-au depus toate eforturile pentru a reduce la minimum suferința.
Tratamente
Pentru a optimiza un protocol pentru expunerea larvelor la dietele HF și HFC, am evaluat mai întâi consumul de dietă martor de către larvele de pește zebră. Am hrănit 100 de larve într-un rezervor de pește de 2 L cu 30 mg-180 mg pe zi pentru a-și îndeplini necesarul de energie de bază. Am constatat că incidența steatozei la larvele de pește zebră a crescut treptat odată cu creșterea cantității de hrănire. Pe baza acestor rezultate, toate tipurile de diete administrate larvelor au fost strict restricționate ca 30 mg/rezervor pe zi. Ezetimibe (Santa Cruz Biotechnology, Texas, SUA) utilizat în acest studiu a fost adăugat direct la apa din rezervorul de pește la concentrații de 1 μM și simvastatină (Cayman Chemicals, Michigan, SUA) a fost adăugată la 50 μg/g alimente. Aceste concentrații de medicamente și metode de administrare au fost alese pe baza raportului anterior așa cum este descris [34].
Roșu de ulei montat integral pe roșu
Larvele de pește zebră au fost postite 24 de ore după hrănire. Larvele întregi au fost apoi fixate în paraformaldehidă (PFA) 4% peste noapte la 4 ° C și spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), infiltrate cu 80% și 100% 1,2 propilen glicol la temperatura camerei respectiv 20 minute și colorate cu 0,5% roșu ulei O (nr. De cat. O0625, Sigma-Aldrich, St. Louis, SUA) în 100% 1,2 propilen glicol în întuneric peste noapte la temperatura camerei. Larvele colorate au fost spălate cu PBS și au estompat culoarea de fundal prin spălare cu 100% și 80% 1,2 propilen glicol timp de 30 de minute fiecare și depozitate în 80% 1,2 propilen glicol la 4 ° C. Picăturile de lipide din țesutul hepatic au fost observate și fotografiate pe un microscop cu disecție pe câmp luminos (Olympus szx10, Tokoyo, Japonia). Larvele au fost definite pozitive pentru steatoză dacă limita dintre ficat și țesutul înconjurător este clară și 3 sau mai multe picături de lipide au fost vizibile în ficat prin colorarea în roșu a uleiului în întregime.
Roșu ulei O colorare a criosecțiilor
Larvele au fost fixate în 4% PFA peste noapte la 4 ° C și infiltrate cu 30% zaharoză peste noapte la 4 ° C. Larvele au fost încorporate în Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Japan Co., Ltd., Tokyo, Japonia) și secțiuni de 10 μm au fost montate pe diapozitive și depozitate la - 80 ° C. Înainte de colorare cu roșu ulei O, lamelele au fost încălzite la temperatura camerei și imersate în 85% și 100% 1,2 propilen glicol timp de 5 minute fiecare, și apoi colorate cu roșu ulei O în întuneric peste noapte la temperatura camerei. Diapozitivele au fost rapid colorate în 100% și 85% propilen glicol în ziua următoare și apoi spălate cu PBS pentru a curăța fundalul. Diapozitivele au fost vizualizate pe un microscop Olympus BX51.
Analiza biologică
Ficatul de 50-70 de larve de pește zebră a fost omogenizat în tampon de liză, centrifugat și obținut lichid supernatant. FC, TC și TG în omogenatele hepatice au fost măsurate folosind kiturile (APPLYGEN Bioengineering, Beijing, China și Nanjing Jiancheng Bioengineering, orașul Nanjing, China) urmând instrucțiunile producătorului și au fost normalizate la concentrația totală de proteine, determinată de Bradford Assay ( Bio-Rad, Hercules, CA).
Analiza histologică
Larvele au fost fixate cu 4% PFA peste noapte, încorporate în parafină conform procedurilor standard. Patru secțiuni de μm au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) și observate la microscopul BX51 (Olympus, Tokyo, Japonia).
RT-PCR cantitativ
ARN-ul total a fost extras din bazinele a 20-30 de ficati disecati si purificat folosind mini kitul RNeasy plus (Qiagen, germana) si transcris invers cu cScript ADNc folosind kitul PrimeScript ™ RT-PCR (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China ). PCR cu transcriere inversă cantitativă (qRT-PCR) a fost efectuată pe Light Cycler 480 (Roche, Basel, Elveția) folosind primerii specifici genei (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). eef1a1 a fost folosit ca referință, iar expresia a fost calculată folosind metoda pragului de ciclu (Ct) (2 -Ct) (țintă)/2 -Cteef1a1))).