Descărcarea scheletului inhibă proliferarea in vitro și diferențierea osteoprogenitorului de șobolan

Veterans Administration Medical Center, Departamentul de Medicină, Universitatea din California, San Francisco 94121; și

Administrația Națională pentru Aeronautică și Spațiu - Centrul de Cercetare Ames, Moffett Field, California 94035

Veterans Administration Medical Center, Departamentul de Medicină, Universitatea din California, San Francisco 94121; și

Abstract

microgravitația asociată cu zborurile spațiale duce la un deficit de masă osoasă la oameni și animale (15, 18). La șobolani, răspunsul osteopenic la microgravitație este asociat cu scăderea numărului de osteoblasti, scăderea formării osoase și întârzierea maturării osoase (4, 15). Modificări similare pot fi induse la nivelul membrelor posterioare ale șobolanului prin creșterea membrelor posterioare (3, 4, 6, 7, 27). Deși osteoblastul pare a fi principalul mediator al osteopeniei în aceste modele, mecanismul de bază pentru inhibarea osteoblastelor este neclar. Descărcarea scheletului poate reduce numărul de celule osteoprogenitoare sau poate inhiba proliferarea acestora, după cum sugerează scăderea numărului de osteoblasti în osul descărcat (7) și proliferarea scăzută a osteoblastilor de cultură izolați de oasele descărcate (12, 27). Diferențierea osteoblastelor poate fi, de asemenea, inhibată, așa cum sugerează inhibarea mineralizării și maturarea osului descărcat (3, 6) și expresia modificată a genelor asociate cu diferențierea osteoblastelor în osul descărcat (4).

Protocoale animale și prelucrarea țesuturilor.

A fost efectuat un experiment separat pentru a examina efectele creșterii membrelor posterioare asupra proliferării BMSC și asupra activității AP. Șobolanii au fost ridicați la nivelul membrelor posterioare timp de 0 sau 5 zile ( = 12/grup), iar celulele lor de măduvă tibială au fost îndepărtate și combinate pentru a produce patru bazine independente de celule per grup, fiecare dintre care a inclus celulele de măduvă tibială stângă și dreaptă de la trei animale. Celulele au fost cultivate în plăci cu șase godeuri, așa cum este descris mai jos, timp de până la 28 de zile pentru a examina cursul de proliferare și activitatea enzimei AP.

Metode de cultură celulară.

Izolarea ARN-ului.

După 10, 15, 20 și 28 de zile de cultură, ARN-ul total a fost izolat din fiecare bazin de celule tibiale cu un kit ARN Stat-60 (TelTest, Friendswood, TX). ARN a fost diluat în apă tratată cu dietilpirocarbonat, iar concentrația și puritatea au fost evaluate cu un spectrofotometru Uvikon (Research Instruments International, San Diego, CA). ARN a fost electroforizat pe un gel de agaroză SeaKem 1% (FMC Bioproducts, Rockland, ME) conținând bromură de etidiu și vizualizat sub lumină ultravioletă (UV) pentru a-i confirma integritatea. Douăzeci de micrograme de ARN total din fiecare piscină au fost transcrise invers în ADNc folosind primeri oligo (dT) și un kit de transcriere inversă GIBCO Superscript II (GIBCO).

Clonarea șabloanelor de ADNc concurente pentru QC-PCR.

QC-PCR.

Gena GAPDH a fost utilizată pentru a controla potențialele variații ale eficienței transcrierii inverse între diferitele grupuri de ADNc. Nivelurile GAPDH au fost determinate în triplicat pentru toate grupurile de ADNc, iar datele pentru c-fos, AP și expresia genei osteocalcinei au fost apoi normalizate la niveluri de GAPDH și exprimate ca nanograme pe micrograme de GAPDH. Înainte de transcriere inversă, alicote de ARN au fost supuse analizei Northern blot cu o sondă GAPDH (datele nu sunt prezentate). Această analiză a demonstrat că expresia genei GAPDH nu a fost influențată de creșterea membrelor posterioare sau de durata în cultură și a fost astfel o genă de menaj validă pentru a controla potențialele variații ale eficienței transcripției inverse între cele 36 de grupuri de ADNc independente.

Proliferarea celulară și teste de activitate AP.

Mineralizarea in vitro.

După 28 de zile de cultură, vasele de 10 cm conținând BMSC femurale au fost clătite cu soluție salină tamponată cu fosfat și fixate timp de 1 oră cu 10% Formalin. După ce culturile fixe au fost clătite cu apă distilată, au fost colorate timp de 5 minute cu roșu de alizarină 1% în etanol 2% pentru a dezvălui mineralul. Culturile au fost apoi clătite de cinci ori cu apă distilată pentru a îndepărta pata legată slab. Nodulii colorați rezultați au fost prea numeroși pentru a se cuantifica cu exactitate, astfel încât pata a fost solubilizată timp de 30 de minute la temperatura camerei cu 0,5 N HCl-5% dodecil sulfat de sodiu (SDS). Pata solubilizată a fost îndepărtată de pe plăci și absorbanta a fost măsurată într-un spectrofotometru la 415 nm. Pentru fiecare animal, au fost analizate și mediatizate cinci feluri de mâncare replicate de 10 cm, iar valorile medii pentru șase animale au fost calculate pentru fiecare grup. Experimentele preliminare au demonstrat că absorbanța a fost legată liniar de cantitatea de roșu de alizarină eluată în intervalul măsurat în aceste experimente.

analize statistice.

Diferențele dintre animalele crescute la nivelul membrelor posterioare și cele încărcate în mod normal au fost determinate cu o analiză a varianței în două direcții (ANOVA) utilizând SigmaStat (Jandel Scientific Software, San Rafael, CA).

Cinci zile de creștere a membrelor posterioare au condus la o scădere semnificativă a greutății fără grăsime a femurului (

Tabelul 1. Efectul creșterii membrelor posterioare asupra greutății corporale, greutății lipidice a femurului și concentrației serice de calciu ionizat

Valorile sunt medii ± SE. HLE, elevația membrelor posterioare.

* În mod semnificativ mai puțin decât controlul (0 zile HLE) și 2 zile HLE, † În mod semnificativ mai mare decât controlul,

FIG. 1.Expresia lui c-fos ARNm de celule stromale din măduva osoasă cultivate (BMSC). Reacția în lanț cantitativă competitivă a polimerazei (QC-PCR) a fost utilizată pentru a cuantifica c-fos Nivelurile de ARNm în triplicat pentru fiecare grup de ADNc și standardizate la niveluri de gliceraldehid fosfat dehidrogenază (GAPDH) în același grup. Deschideți bare, comenzi [0 zile înălțimea membrului posterior (HLE)]; bare gri, 2 zile HLE; și bare hașurate, 5 zile HLE. Grupul HLE de cinci zile este semnificativ mai mic decât grupurile HLE de 0 zile [analiza varianței în 2 direcții (ANOVA),

Expresia ARNm AP a fost semnificativ crescută în celulele osteoprogenitoare izolate de la șobolani cu 5 zile de creștere a membrelor posterioare, comparativ cu martorii (Fig.2). Cea mai mare parte a acestei expresii crescute s-a manifestat în timpul timpurilor timpurii în cultură (10 și 15 zile), iar creșterea generală pe parcursul perioadei de cultură a fost de 61% comparativ cu martorii (

FIG. 2.Exprimarea ARNm fosfatazei alcaline (AP) de către BMSC cultivate. QC-PCR a fost utilizat pentru a cuantifica nivelurile AP mARN de trei ori pentru fiecare grup de ADNc și standardizat la niveluri de GAPDH în același grup. Bare deschise, comenzi (0 zile HLE); bare gri, 2 zile HLE; și bare hașurate, 5 zile HLE. Grupul HLE de cinci zile este semnificativ mai mare decât grupul HLE de 0 zile (ANOVA cu 2 căi,