Definiția oligozaharidelor antiinflamatorii derivate din galactozaminogalactan (GAG)
Markus Gressler
1 Unité des Aspergillus, Institut Pasteur, Paris, Franța
Christoph Heddergott
1 Unité des Aspergillus, Institut Pasteur, Paris, Franța
Inés C. N'Go
1 Unité des Aspergillus, Institut Pasteur, Paris, Franța
Giorgia Renga
2 Departamentul de Medicină Experimentală, Universitatea din Perugia, Perugia, Italia
Vasilis Oikonomou
2 Departamentul de Medicină Experimentală, Universitatea din Perugia, Perugia, Italia
Silvia Moretti
2 Departamentul de Medicină Experimentală, Universitatea din Perugia, Perugia, Italia
Bernadette Coddeville
3 Unitatea de Glicobiologie Structurală și Funcțională (UGSF) UMR 8576 CNRS, Universitatea din Lille, Lille, Franța
Joana Gaifem
4 Institutul de Cercetări în Științele Vieții și Sănătății (ICVS), Facultatea de Medicină, Universitatea din Minho, Braga, Portugalia
5 ICVS/3B's-PT Laborator asociat guvernamental, Braga, Portugalia
Ricardo Silvestre
4 Institutul de Cercetări în Științele Vieții și Sănătății (ICVS), Facultatea de Medicină, Universitatea din Minho, Braga, Portugalia
5 ICVS/3B's-PT Laborator asociat guvernamental, Braga, Portugalia
Luigina Romani
2 Departamentul de Medicină Experimentală, Universitatea din Perugia, Perugia, Italia
Jean-Paul Latgé
1 Unité des Aspergillus, Institut Pasteur, Paris, Franța
Thierry Fontaine
1 Unité des Aspergillus, Institut Pasteur, Paris, Franța
Date asociate
Toate seturile de date generate pentru acest studiu sunt incluse în articol/Material suplimentar.
Abstract
Galactosaminogalactanul (GAG) este un polimer aminosugar insolubil produs de Aspergillus fumigatus și are proprietăți antiinflamatorii. Aici, au fost investigate secvențele glicozidice minime necesare pentru inducerea IL-1Ra de către celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC). Folosind degradarea chimică a GAG-ului nativ pentru a izola oligomerii solubili, am constatat că de-N-acetilarea reziduurilor de galactozamină și dimensiunea oligomerului sunt critice pentru răspunsul imun in vitro. Pentru răspunsul antiinflamator este necesară o dimensiune minimă a oligomerului de 20 de resturi de galactozamină, dar prezența reziduurilor de galactoză nu este necesară. Într-un model de șoarece de colită indus de sulfat de dextran, o fracțiune de oligomeri de-N-acetilați din 13 Cuvinte cheie: galactosaminogalactan, Aspergillus fumigatus, IL-Ra, răspuns antiinflamator, glicodrug
Introducere
Modificarea chimică a polizaharidelor
De-N-acetilarea polizaharidelor
GAG a fost suspendat în 3 ml HCl 10 mM la o concentrație finală de 3,33 mg/ml prin sonicare în tuburi de plastic. De-N-acetilarea a fost începută prin adăugarea a 3,4 ml de NaOH 18,8 M și amestecul a fost incubat la 100 ° C timp de până la 4-5 ore. Tuburile erau agitate în fiecare oră. Reacția a fost oprită pe gheață și neutralizată cu HCI 12 M. Amestecul a fost tamponat cu 20 mM Tris, pH 7. GAG-urile de-N-acetilate (dGAG) au fost dializate împotriva apei de la robinet și de două ori împotriva dH20 (24 ore fiecare) și în cele din urmă liofilizate la sec și depozitate la temperatura ambiantă.
Acetilarea oligozaharidelor
Procedura de acetilare descrisă de Lavertu și colab. (2012) a fost modificat după cum urmează: 0,5 mg oligozaharide dGAG (F-I și F-III) au fost liofilizate până la uscare și au fost rezolvate în 25 μl de acid acetic 400 mM și 100 μl CH3OH. Amestecul a fost preincubat timp de 1 oră la temperatura ambiantă sub agitare la 300 rpm. Acetilarea a fost inițiată prin adăugarea a 3 μl de anhidridă acetică. După 1 oră de incubare, solvenții au fost evaporați într-un desicator peste noapte. Probele au fost desalinizate prin dizolvare repetată cu 500 μl de apă (de 4 ori) urmată de evaporare la sec. Probele au fost rezolvate în 500 μl de apă și în cele din urmă depozitate la -20 ° C.
Producerea de oligozaharide GAG
Proceduri analitice
Analiza MBTH
Osminele de-N-acetilate au fost detectate și cuantificate prin testul MBTH (Plassard și colab., 1982). Procedura a fost efectuată pe o placă cu 96 de godeuri (Sarstedt): 40 μl probă (conținând până la 200 μg osmini/ml) au fost amestecate cu 40 μl KHSO4 5% (Sigma Aldrich). Probele au fost reduse prin adăugarea a 40 pl de NaNO2 5% (Sigma Aldrich) timp de 60 min la 50 ° C, prin care s-au folosit 40 pl de NaCI 5% ca martor negativ. După neutralizare cu 40 μl 12,5% NH4SO2NH2 (Sigma Aldrich) (temperatura ambiantă, 30 rpm, 10 min), s-a adăugat 40 μl 0,5% 3-metil-2-benzotiazolinonă hidrat clorhidrat de hidrat (Sigma Aldrich). Placa acoperită a fost incubată la 37 ° C timp de 30 de minute. În cele din urmă, s-a adăugat 40 μl 0,5% FeCl3 și absorbția la λ = 650 nm a fost măsurată de cititorul de plăci ELISA infinit M200Pro Tecan, în timp ce λ = 800 nm a servit ca lungime de undă de referință. O curbă de calibrare a unei diluții seriale de d-galactozamină (GalN) a servit drept referință. Pentru a cuantifica cantitatea totală de osmină sau gradul de acetilare (DA), a fost efectuată o etapă de hidroliză înainte de testul MBTH. Probele au fost complet hidrolizate cu HCI 4 M la 100 ° C timp de 4 ore și ulterior uscate peste noapte într-un desicator.
Analiza acetatului
DA a fost, de asemenea, estimată prin testul acetat enzimatic. Probele (220 μl) au fost complet hidrolizate prin adăugarea a 100 μl de HCl 12 M (100 ° C, 4 h). Apoi, 100 μl au fost folosiți pentru detectarea osminei prin testul MBTH așa cum este descris mai sus și alți 100 μl au fost folosiți pentru testul acetat. După neutralizare prin adăugare de 75 μl 7 M NaOH și 75 μl 2 M MOPS (pH 7,5), probele au fost supuse testului colorimetric al acetatului (Sigma-Aldrich) conform protocolului producătorului. Absorbția la λ = 450 nm a fost măsurată de cititorul de plăci ELISA infinit Tecan M200Pro, în timp ce λ = 700 nm a servit ca lungime de undă de referință. Conținutul de acetat din probele hidrolizate a fost determinat printr-o curbă de calibrare de 0,25-1,5 mM soluție standard de acetat.