Deficitul de adipos brun YY1 activează expresia proteinelor secretate legate de cheltuielile de energie
Francisco Verdeguer
un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
Meghan S. Soustek
un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
Maximilian Hatting
un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
c Facultatea de Medicină, Universitatea RWTH Aachen, Aachen, Germania
Sharon M. Blättler
un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
Devin McDonald
un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
Joeva J. Barrow
un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
Pere Puigserver
un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA
Abstract
INTRODUCERE
Recent, s-a demonstrat că factorii sistemici reglează termogeneza țesutului adipos maro și bej, inclusiv factorul de creștere a fibroblastelor 21 (FGF21) (26), proteina morfogenetică osoasă 4 (BMP4) (27), BMP7 (28), BMP8b (29), FGF19 (30), factor de diferențiere a creșterii 5 (GDF5) (31), peptide natriuretice (32), prostaglandine (33, 34), factor de creștere endotelial vascular (VEGF) (35), acid β-aminoisobutiric (BAIBA) (36), asemănătoare meteorinei (14) și irisinei (37). Acești factori sunt implicați în controlul cheltuielilor de energie și al greutății corporale prin modularea BAT sau a grăsimii bej. În acest context, dacă factorii secretați de BAT pot contribui la cheltuirea energiei sau pentru a compensa termogeneza BAT defectă prin activarea altor țesuturi termogene, inclusiv a țesutului adipos bej sau alb, este puțin înțeles.
Aici, raportăm că pierderea YY1 în BAT duce la o supresie puternică a expresiei genelor mitocondriale și termogene. În ciuda funcției termogene BAT reduse, șoarecii cu deficit de YY1 sunt protejați împotriva obezității induse de dietă și au activat țesutul adipos bej și alb termogen. Arătăm că YY1 are un control antagonist al genelor BAT, prin faptul că activează gene legate de termogeneza adaptivă prin activarea căii canonice termogene, dar suprimă o serie de proteine secretate, inclusiv FGF21, BMP8b și GDF15, care activează energia corpului întreg cheltuieli.
MATERIALE ȘI METODE
Experimente pe animale.
Toate experimentele și protocoalele au fost aprobate de Comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor de la Dana Farber Cancer Institute sau Beth Israel Deaconess Medical Center. Șoarecii YY1-Ucp1Cre și YY1-AdipoCre au fost generați de animale de reproducție care adăpostesc o alelă YY1 floxată (38) cu șoareci transgenici care exprimă Ucp1 Cre (39) sau respectiv Adiponectin Cre recombinază (40). Pentru experimentele de tip sălbatic de șoarece, șoareci C57BL/6 de 8 săptămâni au fost cumpărați de la Taconic Farms. Șoarecii au fost menținuți pe o dietă standard sau 60% dietă bogată în grăsimi (HFD) (Research Diets) cu cicluri de 12 ore. Pentru experimentele de expunere la rece, șoarecii au fost plasați în incubatoare de 4 ° C sau 30 ° C la momentele indicate, iar temperatura corpului a fost măsurată cu o sondă rectală. Pentru studii metabolice, cheltuielile de energie au fost analizate folosind un sistem cuprinzător de monitorizare a animalelor de laborator (Columbus Instruments). Șoarecii au fost aclimatizați timp de 24 de ore înainte de efectuarea măsurătorilor. S-au efectuat măsurători de imagistică prin rezonanță magnetică (RMN) la șoareci întregi într-un instrument de scanare CITI.
Expresia genelor și analiza Western blot.
ARN-ul total din celule sau țesuturi cultivate a fost purificat folosind TRIzol (Invitrogen) pentru sinteza ADNc (kit ABI de mare capacitate). Expresia relativă a ARNm a fost cuantificată prin PCR cantitativă (qPCR) folosind colorant verde SYBR (ABI) și primerii specifici (datele nu sunt prezentate). Pentru Western blot, lizații de celule întregi au fost preparați cu tampon de test radioimunoprecipitare (RIPA), separat prin SDS-PAGE, și transferați la membranele Immobilon-P (Millipore). Pentru detectarea GDF15 circulant, s-a folosit 1 μl de plasmă pentru SDS-PAGE. Au fost utilizați următorii anticorpi: anti-YY1 (Santa-Cruz), anti-UCP1 (Abcam), anti-NDUFA9 (Abcam), anti-succinat dehidrogenază (anti-SDHA) (Abcam), antiaconitază (Abcam), anti-GDF15 (Abcam), anti-MTCO1 (Abcam), anti-UQCRC2 (Abcam), pCREB (Cell Signaling), CREB total (Cell Signaling) și antitubulin (Millipore).
Coimmunoprecipitații.
Un grup de țesut adipos maro interscapular de la 5 șoareci a fost omogenizat cu un pistil motorizat în 4 ml tampon de izolare nucleară (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM ditiotreitol [DTT], inhibitori de protează complete [ Roche]) și incubat pe gheață timp de 10 min. Nucleele au fost peletizate prin centrifugare la 3.200 × g timp de 5 min și spălate în 4 ml din același tampon înainte de centrifugare la 3.200 × g timp de 5 min. Peletele de nucleu au fost apoi resuspendate în 600 μl de tampon de imunoprecipitare (0,1% NP-40, 150 mM NaCI, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, Inhibitori de protează complete [Roche]). Două sute de micrograme de proteină au fost incubate cu 3 μg de anticorp YY1 (sc1703; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) sau IgG de iepure pentru controale peste noapte la 4 ° C cu rotație. Imunocomplexele au fost precipitate cu margele magnetice de proteină G (DynaBeads; Invitrogen) în timpul unei rotații de 1 oră la 4 ° C. Probele au fost apoi spălate de 5 ori în tampon de imunoprecipitare. Probele au fost fierte în cele din urmă și supernatantele au fost rulate pe SDS-PAGE, inclusiv probe de intrare pentru detectarea Western blot folosind anticorp PGC-1α (Santa Cruz), anticorp YY1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) și lamin B1 (Abcam).
Linia celulară de grăsime brună De2.3 a fost tratată cu dimetil sulfoxid (DMSO) sau 10 μM forskolin la 10 μM timp de 4 ore. Nucleii au fost izolați direct prin incubarea peletelor celulare cu tampon de izolare nucleară. Același protocol a fost utilizat pentru țesutul de grăsime brună pentru a coimmunoprecipita complexul YY1 - PGC-1α.