Cristalizarea proteinelor; Știri-Medical
Cristalizarea proteinelor este un instrument important pentru purificarea proteinelor, precum și pentru demonstrarea purității lor chimice.
Acest proces este esențial pentru cristalografia cu raze X, un câmp care a contribuit enorm la înțelegerea structurii atomice și moleculare chiar și la niveluri de proteine și acid nucleic. Aceste cristale ajută la delimitarea structurii tridimensionale a macromoleculelor complexe și a funcțiilor acestora, precum și a modului în care acestea funcționează în lumea reală.
Principiu
Cristalizarea proteinelor se bazează pe combinația atentă a soluției suprasaturate a compusului cu reactivi de precipitare sau cristalizare în condițiile de laborator potrivite pentru a induce nucleația și creșterea unui cristal proteic.
Procedură
Următorii pași sunt urmați pentru cristalizarea unei proteine:
Caracterizarea proteinelor
Cel puțin câteva miligrame de proteină trebuie purificate și apoi caracterizate prin spectroscopie cu dicroism circular (CD) pentru a studia structura și activitatea proteinei, fluorometria de scanare diferențială, împrăștierea dinamică a luminii care asigură polidispersitate scăzută sau ultracentrifugare. De asemenea, trebuie studiată stabilitatea proteinelor în prezența diferiților aditivi și liganzi. Acest pas este esențial pentru succesul cristalografiei.
Cristalizarea proteinelor
Acest proces depinde de legile fizice și chimice și este rezultatul precipitării unei soluții de proteine suprasaturate. Incapacitatea de a utiliza temperaturi ridicate pentru a realiza suprasaturarea proteinelor este depășită folosind alți factori, cum ar fi diferite tipuri de sare în soluție tampon, sau folosind co-factori pentru a crește solubilitatea proteinei. Precipitanții în utilizare obișnuită includ sulfat de amoniu și polietilen glicol. Soluțiile comerciale de screening premade sunt utilizate pentru a afla tipul de condiții care favorizează cristalizarea proteinelor. Aceste condiții sunt apoi optimizate pentru a permite creșterea cristalelor pure mari care pot fi supuse cristalografiei cu raze X.
Cele mai frecvent utilizate metode pentru cristalizarea proteinelor includ picătura suspendată și picătura așezată, ambele utilizate cu metodele de difuzie a vaporilor.
Dificultăți cu cristalizarea proteinelor
Proba trebuie să fie pregătită și purificată cu grijă și solubilizată în mediul tampon potrivit pentru a produce cristale. Scopul pregătirii probei este cea mai mare puritate și monodispersiune posibilă.
Povești conexe
Stabilitatea este o altă preocupare principală. Depozitarea trebuie să prevină orice deteriorare în ceea ce privește schimbarea conformațională sau denaturarea, oligomerizarea sau orice astfel de modificare înainte sau în timpul procesului de formare a cristalelor.
Supersaturarea se realizează apoi utilizând combinația corectă de reactivi, pH-ul tamponului, temperatura potrivită și excipienți sau aditivi. Moleculele proteice sunt încurajate să se asocieze în mod ordonat fără precipitații sau separare de faze sau agregare dezordonată. Odată ce nucleația este indusă în mod adecvat, cu un număr, o dimensiune și o calitate adecvate, mediul trebuie să aibă tendința de a restricționa nucleația ulterioară și de a promova creșterea cristalelor controlată. Odată crescute, cristalele trebuie protejate împotriva daunelor fizice sau chimice.