Crioconservarea permite conservarea pe termen lung a speciilor pe cale de dispariție critică Rubus humulifolius

Abstract

Introducere

Procesul și metodele de crioconservare permit supraviețuirea pe termen lung a organismelor la temperaturi de azot lichid (LN) (- 196 ° C). În depozitarea LN, unul dintre avantaje este amânarea pe termen lung a costurilor de regenerare. Deși nici o probă biologică nu este nemuritoare, exemplarele din depozitarea LN vor avea o durată de viață nedeterminată (Li și Pritchard 2009). Crioconservarea este singura ex situ metoda de conservare pentru conservarea pe termen lung a speciilor care nu pot fi depozitate în băncile de semințe, de ex. culturi clonale sau specii cu număr redus sau semințe recalcitrante. Mai mult, necesitând doar un spațiu minim și eforturi de întreținere, crioconservarea sa dovedit a fi un instrument foarte important pentru depozitarea pe termen lung a materialului genetic plantelor (Engelmann 2004; Matsumoto 2017).

Cele mai frecvent utilizate tehnici de crioconservare sunt vitrificarea, deshidratarea prin încapsulare, răcirea cu rată controlată și conservarea inactivă a mugurilor (Benson 2008; Benelli și colab. 2013; Jenderek și Reed 2017). Vitrificarea este un proces fizic în care soluția se solidifică într-o sticlă metastabilă la temperaturi foarte scăzute și evită cristalizarea (Sakai și colab. 2008). Multe protocoale de vitrificare a plantelor utilizează două tehnici principale: adăugarea de aditivi crioprotectori la concentrații foarte mari și îndepărtarea apei prin desicarea prin evaporare și deshidratarea osmotică. Un crioprotector acționează ca o substanță antigel și trebuie să fie netoxic pentru celulă la concentrația necesară pentru a fi eficientă (Benson 2008).

Rubus humulifolius plante din populația Jyväskylä au fost menținute in vitro în Grădina Botanică a Universității din Oulu din 2006 (20 de plantule prezentând toate una R. humulifolius clonă). Mai recent, R. humulifolius a fost inclusă ca specie țintă în proiectul UE Life + Ex Situ Conservation of Finnish Native Plant Species (ESCAPE) (LIFE + 2011 BIO/FI/917 ESCAPE; https://luomus.fi/en/exsitu-conservation-finnish -specii -plante-native). În timpul acestui proiect, am dezvoltat protocolul de crioconservare pentru R. humulifolius pentru a permite o conservare pe termen lung a germoplasmei populațiilor separate ale speciei.

Materiale și metode

Material vegetal

Culturi in vitro de micropropagate R. humulifolius C. A. Plantele Mey întreținute la Laboratorul de Biotehnologie al Grădinilor Botanice de la Universitatea din Oulu au fost utilizate ca material explicativ pentru prezentul studiu. Materialul vegetal a fost primit inițial de la Institutul de Resurse Naturale, Finlanda, unde a fost dezvoltat protocolul de micropropagare pentru a restabili speciile care reprezintă cel mai vestic habitat al R. humulifolius (Kypärämäki, Jyväskylä, Finlanda ETRS-TM35FIN: N 6901644, E 432210).

Cultivarea in vitro

Cultivarea/menținerea in vitro a R. humulifolius plantele au fost efectuate pe mediu ½ MS (Murashige și Skoog 1962) cu 0,1 mg/l BAP, 0,05 mg/l NAA, 100 mg/l mioinozitol, 30 g/l zaharoză și 7,6 g/l agar la 22 ° C sub 16/8 fotoperioadă. Iluminarea a fost asigurată de tuburi fluorescente (Osram L 30 W/830) cu o intensitate de 107-128 µmol/m 2/s. Plantele au fost transferate în mediu proaspăt la un interval de 3 luni.

Protocol de crioconservare

Pentru crioconservare a R. humulifolius, a fost utilizată o metodă de vitrificare prin picurare. În prezentul studiu, crioconservarea s-a făcut ca în protocolul de vitrificare prin încapsulare dezvoltat inițial pentru zmeură (Rubus idaeus) dar fără etapa de încapsulare (Wang și colab. 2005). Am studiat efectul unui pretratament de 10 zile cu sau fără acid abscisic (0, 2 sau 4 mg/l ABA) efectuat pe muguri de 1 lună disecați din lăstari multipli de plante in vitro. Pentru control, protocolul de crioconservare (vezi mai jos) a fost aplicat imediat după disecție (Tratamentul 1 din Tabelul 2). De asemenea, am studiat efectul intervalului de propagare asupra succesului crioconservării R. humulifolius. Mugurii au fost colectați de la plante donatoare de 1, 2 sau 4 luni (din ultima subcultură), denumiți ulterior ca vârstă in vitro. Toate experimentele/tratamentele au inclus muguri de control necrioconservați (tratați ca aceia crioconservați, dar fără înghețare în LN) și toate etapele de lucru din timpul procedurii de crioconservare au fost făcute aseptic. Mugurii din fiecare tratament au avut trei replici (trei plăci Petri/tratament) și experimentul a fost făcut o dată.

Pentru crioconservare, mugurii (dimensiunea de 2-4 mm) fie cu sau fără pretratare au fost mai întâi preculturați pe mediu ½ MS cu 0,1 mg/l BAP, 0,05 mg/l NAA, 100 mg/l mio-inozitol inclusiv 0,25, 0,5 și 0,75 M zaharoză pentru o zi pe concentrație (Fig. 1a). După aceea, mugurii au fost transferați în soluția de încărcare (0,75 M zaharoză, 2 M glicerol, ½ MS) timp de 90 de minute. După aceea, mugurii au fost vitrifiați în soluția 2 de vitrificare a plantelor (PVS2: 30% glicerol, 15% etilen glicol, 15% DMSO, 0,4 M zaharoză în ½ MS) timp de 3 ore. Incubațiile în soluție de încărcare și PVS2 au fost efectuate prin plasarea mugurilor pe plăci mici Petri umezite cu câte 2 ml din fiecare soluție la un moment dat. Etapele de precultură, încărcare și vitrificare au fost efectuate la temperatura camerei (RT). După crioprotecție în PVS2, bucățile de folie de aluminiu (0,5 × 1,5 cm) au fost preparate cu picături de 2-3 μl de PVS2 (Fig. 1b) și mugurii au fost transferați în picături (5 pe folie) și crioconservate prin transferarea rapidă a foliilor criotuburi umplute cu azot lichid (LN) timp de cel puțin 1 oră.

A. Rubus humulifolius muguri după tratamentul cu zaharoză. . Benzi de folie cu picături PVS2. c. Mugur regenerant la 2 săptămâni după crioconservare. d. Material crioconservat la 2 luni după crioconservare. e. Material crioconservat la 2 săptămâni după transfer în condiții ex vitro. f. Crioconservat iernat R. humulifolius plante

Recuperare după crioconservare

Primul pas în recuperarea crioconservării R. humulifolius mugurii dezghețau criotuburile la 40 ° C baie de apă timp de 3 minute. După aceea, criotuburile au fost deschise și foliile cu muguri transferate la 30 ml soluție de descărcare (zaharoză 1 M în ½ MS) la temperatura camerei. După aceea, excesul de umiditate a fost îndepărtat prin transfer pe hârtie de filtru și mugurii au fost cultivați pe mediu ½ MS cu 0,1 mg/l BAP, 0,05 mg/l NAA, 100 mg/l mioinozitol și 30 g/l zaharoză în Petri plăci timp de 4 zile în întuneric înainte de transferul la lumină în camera de cultură. Supraviețuirea (S) și regenerarea (R) mugurilor au fost estimate la mai multe puncte de timp (între 1 și 5 săptămâni) sub stereomicroscop. Mugurii clasificați ca supraviețuitori (S) au inclus ambii muguri regeneranți (R) adică muguri care formează lăstari noi (Fig. 1c) și muguri care erau în viață, dar nu se regenerau.