Contribuția relativă a NMDAR-urilor la curenții excitatori postsinaptici este controlată de Ca2
Fliza Valiullina
1 OpenLab de Neurobiologie, Universitatea Federală din Kazan, Kazan, Rusia
Yulia Zakharova
1 OpenLab de Neurobiologie, Universitatea Federală din Kazan, Kazan, Rusia
Marat Mukhtarov
1 OpenLab de Neurobiologie, Universitatea Federală din Kazan, Kazan, Rusia
Andreas Draguhn
2 Departamentul de Fiziologie și Fiziopatologie, Universitatea din Heidelberg, Heidelberg, Germania
Unghii Burnashev
3 INMED, Institutul de Neurobiologie al Mediteranei UMR901, Universitatea Aix-Marseille, Marsilia, Franța
4 INSERM U901, Marsilia, Franța
Andrei Rozov
1 OpenLab de Neurobiologie, Universitatea Federală din Kazan, Kazan, Rusia
2 Departamentul de Fiziologie și Fiziopatologie, Universitatea din Heidelberg, Heidelberg, Germania
Abstract
Introducere
Raportăm că manipularea capacității de tampon Ca 2+ a neuronilor piramidali hipocampici CA1 afectează puternic amplitudinea EPSP-urilor medii NMDAR unice, sub prag. Mai mult, la stimularea aferentă de înaltă frecvență, ameliorarea simultană a blocului Mg 2+ și CIIN a crescut contribuția NMDAR-urilor la EPSP-uri postsinaptice și a prelungit semnificativ timpul lor de decădere. Descoperirile noastre sugerează că fluxul de Ca 2+ indus în timpul evenimentelor sinaptice unitare este suficient pentru a produce inhibarea detectabilă a NMDAR. Activarea repetitivă a sinapselor excitative are ca rezultat o prelungire semnificativă a ferestrei de integrare pentru potențialele de acțiune evocate sinaptic (AP).
Materiale și metode
Toate protocoalele experimentale au fost realizate în conformitate cu reglementările Universității Federale Kazan privind utilizarea animalelor de laborator (aprobare etică de către Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Universității medicale de stat Kazan N9-2013) sau de către guvernul de stat din Baden-Württemberg, Germania . S-au făcut toate eforturile pentru a reduce la minimum suferința animalelor și pentru a reduce numărul animalelor utilizate.
Felii de hipocampal transversale de 250 μm au fost preparate din creierul șoarecilor în vârstă de 14-21 de zile (C57 BL/6J), uciși de luxația cervicală. Camera de feliere conținea o soluție oxigenată răcită cu gheață (modificată din Dugue și colab., 2005) compusă din (în mM): K-Gluconat, 140; Acid N- (2-hidroxietil) piperazin-N'-etansulfonic (HEPES), 10; Na-Gluconat, 15; etilen glicol-bis (2-aminoetil) -N, N, N ', acid N'-tetraacetic (EGTA), 0,2; și NaCI, 4 (pH 7,2). Feliile au fost incubate timp de 30 min la 35 ° C înainte de a fi depozitate la temperatura camerei (22-24 ° C) în CSF artificial (ACSF) conținând (în mM): NaCI, 125; NaHCO3, 25; KCI, 2,5; NaH2PO4, 1,25; MgCI2, 1; CaCI2, 2; și glucoză, 25; barbotat cu 95% O2 și 5% CO2. ACSF fără Mg 2+ a avut 0 mM MgCl2 și 0,2 mM EDTA.
Electrozii de patch-uri au fost scoși din sticlă capilară dură de borosilicat (extractor de micropipete flacără/maro Sutter Instruments). În experimentele efectuate în modul tensiune-clamp, soluția intracelulară a constat din (în mM): Cs-gluconat, 100; CsCI, 40; HEPES, 10; NaCI, 8; MgATP, 4; MgGTP, 0,3; fosfocreatină, 10 (pH 7,3 cu CsOH). În experimentele cu cleme curente, Cs + a fost substituit cu K + în soluția de pipetă.
În timpul înregistrărilor, rezistența membranei a fost monitorizată și datele din celule în care rezistența membranei a variat cu> 15% au fost eliminate din analiză. De-a lungul articolului n se referă la numărul de experimente din grup.
Pentru analiza statistică, a fost utilizat testul Mann-Whitney, iar datele sunt prezentate ca medie ± SD, dacă nu se specifică altfel.
Rezultate
Intrarea Ca 2+ în timpul răspunsurilor sinaptice unitare sub-prag este suficientă pentru a declanșa CIIN
Efectul tampoanelor Ca 2+ asupra amplitudinii EPSC mediată de NMDAR în soluția extracelulară fără Mg 2+. (A) Compusul evocat mediu EPSC (albastru), aEPSC (roșu), nEPSC (negru) la -70 mV și nEPSC (verde) la 50 mV înregistrat cu soluții intracelulare fără tampon și conținând EGTA. Histogramele cu bare compară efectul încărcării tamponului asupra raporturilor de amplitudine ale aEPSC-urilor măsurate la -70 mV la nEPSC-uri măsurate la -70 mV (stânga) și 50 mV (dreapta). (B) Trenuri medii de EPSC mediate de NMDAR înregistrate cu soluții fără EGTA și conținând EGTA. Histogramele cu bare arată efectul încărcării EGTA asupra raporturilor de amplitudine (PPR) ale celui de-al doilea (stânga) și al cincilea (dreapta) nEPSC la amplitudinea primului răspuns. Asteriscurile indică o diferență semnificativă.
Pentru a testa dacă gradul CIIN poate fi crescut prin stimulare sinaptică prelungită sub prag, am măsurat și comparat raporturile de amplitudine ale celui de-al doilea (NMDA2) și al cincilea (NMDA5) nEPSCs cu primul nEPSC (NMDA1), utilizând un protocol de stimulare cu cinci impulsuri (10 Hz) în neuronii încărcați cu soluții intracelulare fără tampon sau conținând EGTA (Figura (Figura 1B). 1B). Raportul mediu NMDA2/NMDA1 a crescut ușor, dar nu semnificativ, prin încărcarea tamponului (fără EGTA: 1,23 ± 0,11, n = 6; conținând EGTA: 1,36 ± 0,21, n = 5; p = 0,662). Răspunsurile ulterioare, cu toate acestea, au fost clar îmbunătățite prin tamponarea Ca 2+: raportul NMDA5/NMDA1 a fost de 0,9 ± 0,15 în neuronii corecți cu soluție fără EGTA (n = 6) și 1,28 ± 0,21 în neuronii care conțin EGTA (n = 5; p = 0,009). Aceste date indică faptul că CIIN modifică contribuția NMDAR la răspunsurile unitare, cu un impact mai puternic asupra curenților mediați de NMDAR în timpul activității repetitive prelungite.
În prezența Mg 2+ CIIN afectează curenții mediați de NMDAR într-un mod independent de tensiune
CIIN reduce puternic amplitudinile nEPSC-urilor la potențiale negative, dar nu modifică dependența de tensiune a blocului Mg 2+. (A) Răspunsuri mediate de NMDAR evocate sinaptic (50 mV) înregistrate la -70, -35, 0, 35 și 50 mV din celule piramidale CA1 dializate cu soluții intracelulare fără tampon, EGTA sau BAPTA. (B, C) Relațiile de tensiune curente ale nEPSC-urilor s-au normalizat la amplitudini la 50 mV (B) și -70 mV (C) obținut cu soluții intracelulare fără tampon (roșu), EGTA- (negru) și conținând BAPTA (verde).
Contribuția relativă a NMDAR la răspunsurile postsinaptice este puternic controlată de CIIN
Pentru a fundamenta în continuare rolul modulator al CIIN în condiții fiziologice și pentru a estima impactul acestuia asupra amplitudinii compușilor EPSC, am comparat răspunsurile mediate de AMPAR și NMDAR măsurate la -70 și -35 mV în neuroni, cu patch-uri fără tampon și pipetă care conține tampon. soluții. La ambele potențiale de reținere, amplitudinile relative ale nEPSC-urilor înregistrate din celulele dializate cu soluție intracelulară fără tampon au fost semnificativ mai mici comparativ cu cele măsurate cu EGTA (10 mM) sau BAPTA (1 mM), după cum se indică prin rapoarte AMPA/NMDA mult mai mici (Figurile 3A, B).
Efectul CIIN asupra contribuției NMDAR la EPSC compuse. (A) Răspunsurile mediate de AMPAR- (roșu) și NMDAR- (negru) înregistrate la -70 și -35 mV de la neuroni cu soluție de pipetă fără tampon sau conținând tampon. (B) Histogramele cu bare compară efectele încărcării EGTA sau BAPTA asupra raporturilor AMPA/NMDA obținute la −70 (stânga) și −35 mV (dreapta). (C) IV ponderate ale aEPSC-urilor sinaptice (cercuri) și nEPSC-urilor (triunghiuri) măsurate din neuroni dializați cu soluții intracelulare fără tampon (roșu), EGTA- (negru) sau BAPTA-care conțin (albastru). (D) Dependența de tensiune a contribuției relative NMDAR la EPSC sinaptic în prezența sau absența bufferelor Ca 2+. Etichetarea este la fel ca pe (C). Asteriscurile indică o diferență semnificativă.