Comparație proteomică prin iTRAQ combinată cu spectrometria de masă a proteinelor din albușul de ou la găinile ouătoare

Conceptualizare roluri, curatarea datelor, analiză formală, metodologie, software, validare, scriere - schiță originală, scriere - revizuire și editare

Adresa actuală: Universitatea Sichuan, Chengdu, Sichuan, China

Laborator cheie de afiliere a biotehnologiei furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de cercetare a furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Metodologie

Laborator cheie de afiliere pentru biotehnologia furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de Cercetare a Furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Roluri Arhivarea datelor, Software

Laborator cheie de afiliere a biotehnologiei furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de cercetare a furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Investigarea rolurilor, administrarea proiectelor, supravegherea

Laborator cheie de afiliere a biotehnologiei furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de cercetare a furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Roluri Analiză formală, investigație

Laborator cheie de afiliere a biotehnologiei furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de cercetare a furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Roluri Conceptualizare, Metodologie, Administrarea proiectelor, Supraveghere, Scriere - revizuire și editare

Laborator cheie de afiliere a biotehnologiei furajelor din Ministerul Agriculturii, Institutul de cercetare a furajelor, Academia Chineză de Științe Agricole, Beijing, China

Tao He,
Haijun Zhang,
Jing Wang,
Shugeng Wu,
Hongyuan Yue,
Guanghai Qi

Cifre

Abstract

Făina de semințe de bumbac (CSM) este frecvent utilizată în dietele găinilor pentru a înlocui făina de soia (SBM). Cu toate acestea, consecințele moleculare ale acestei substituții rămân neclare. Pentru a investiga impactul acestei substituții la nivel molecular, iTRAQ combinat cu analiza biochimică a fost efectuat la găinile Hy-Line W-36 suplimentate cu o dietă mixtă de CSM și SBM. Greutatea ouălor, înălțimea albuminei și unitatea Haugh au fost reduse semnificativ în grupul CSM100 (100% proteină brută din SBM înlocuită cu CSM) comparativ cu grupul SBM (P Tabelul 1. Compoziție și niveluri de nutrienți ai dietelor găinii ouătoare de la 40 la 51 săptămâni de varsta.

Performanță, calitatea albuminei și colecția de mostre

Performanța și parametrii calității albuminei au fost evaluați în timpul procesului de hrănire de 40-51 săptămâni. Greutatea corporală medie a găinilor ouătoare a fost de 1,76 ± 0,2 kg la începutul studiului. Consumul de furaje și raportul de conversie a furajelor (FCR, furaj/ou, g/g) au fost măsurate la fiecare două săptămâni, iar producția de ouă, greutatea ouălor și mortalitatea au fost înregistrate zilnic.

Cinci ouă au fost colectate din fiecare replică la sfârșitul studiului de hrănire pentru a determina indicii de calitate a albuminei. Înălțimea albuminei și HU au fost determinate cu Egg Analyzer (ORKA Food Technology Ltd, Ramat Hasharon, Israel). Toate rezultatele au fost obținute la temperatura camerei.

La sfârșitul săptămânii 51, o găină ouătoare din fiecare replică a fost selectată aleatoriu. Sângele a fost colectat prin vena aripii și centrifugat la 3000 × g timp de 10 minute pentru recoltarea serului, care a fost apoi depozitat la –20 ° C până la analiză. Straturile au fost imediat sacrificate prin dislocarea colului uterin. Magnamul oviductului a fost excizat și fixat în 10% formalină neutră tamponată (Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd., Beijing, China), respectiv.

Evaluarea morfologiei Oviduct magnum și analiza hormonilor

Pentru studii histopatologice, probele de oviduct fixat în formalină (magnum) au fost colorate cu hematoxilină și eozină (HE). Toți reactivii utilizați au fost de calitate analitică (Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. Beijing, China). Modificările histopatologice au fost examinate cu un microscop cu lumină (BX51, Olympus Corp., Tokyo, Japonia). Evaluarea histopatologică a fost efectuată de personal calificat la Departamentul de Patologie Veterinară de la Universitatea de Agricultură din Beijing. Concentrațiile plasmatice de progesteron și estrogen au fost analizate folosind iod [125I] estradiol și un kit de radioimunologie de progesteron (Beijing North Institute of Biological Technology, Beijing, China).

Digestia cu tripsină și etichetarea iTRAQ

Analiza prin spectrometru de masă Q-Exact și procesarea datelor

Interpretarea și cuantificarea datelor

Pentru prelucrarea datelor, am folosit software-ul Proteome Discoverer 1.2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) pentru a interpreta fișierele de date brute produse prin spectrometrie de masă. Baza de date cu proteine CHICK a fost descărcată din baza de date NCBI și combinată cu secvențele inversate și secvențele de contaminanți răspândiți pe scară largă, cum ar fi cheratinele umane. Parametrii pentru căutarea bazei de date au fost după cum urmează: tripsina a fost selectată ca enzimă; două clivaje ratate au fost permise la maximum; toleranța de masă a precursorului a fost setată la 15 ppm; toleranța de masă a fragmentului a fost setată la 20 mmu; carbamidometilarea cisteinei a fost stabilită ca modificare fixă; oxidarea metioninei și etichetele iTRAQ 4plex la capătele N-terminale și la lanțurile laterale ale lizinei au fost permise ca modificare dinamică. S-a aplicat principiul strict de parsimonie maximă și numai meciurile din spectrul peptidic (PSM) cu încredere ridicată sau medie și cu delta Cn mai mare de 0,15 au fost luate în considerare pentru gruparea proteinelor. Vârfurile ionice au fost integrate pe baza celui mai încrezător centroid cu toleranță de 20 ppm. Prin baza de date inversă, rata de descoperire falsă a fost setată la 0,01 pentru a obține un rezultat de încredere ridicat.

Cuantificarea proteinelor a fost realizată și de software-ul Proteome Discoverer 1.2, care a calculat automat abundența relativă a peptidelor marcate cu iTRAQ și a proteinelor corespunzătoare. Numai peptidele unice și cu încredere ridicată au fost luate în considerare pentru cuantificare. Pentru a corecta tendința de pipetare sau determinarea concentrației de proteine în probele mixte, toate raporturile de proteine au fost normalizate de raportul mediu de proteine. Pragurile minime semnificative de reglementare au fost de 1,2. Proteinele cu raporturi ≥1,2 sau ≤0,833 sunt considerate proteine exprimate diferențial.

Western blot

Concentrația de proteine a supernatantului a fost măsurată prin testul de proteină Bradford. Probele care conțin 30 μg de proteine totale au fost separate cu 12% (greutate/volum) SDS-PAGE și transferate pe o membrană PVDF (Millipore, Bedford, MA). După incubare timp de 1 oră cu tampon de blocare (5% (g/v) lapte degresat în TBS-T) (0,05% (v/v) Tween 20 în soluție salină tamponată Tris), membrana a fost sondată cu anticorpii primari indicați diluați în tampon de blocare peste noapte la 4 ° C. După ce a fost spălată extensiv cu TBS-T, membrana a fost incubată cu anticorp conjugat cu peroxidază de hrean pentru iepure (Cell Signaling Technology) diluat în tampon de blocare (1: 2000) timp de 1 oră la temperatura camerei .Bandele au fost vizualizate cu Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrat (Pierce) și înregistrate pe filme cu raze X (Fuji Medical, Tokyo, Japonia) În cele din urmă, benzile vizualizate au fost cuantificate prin software-ul QUANTITY ONE pe un densitometru GS-800 Anticorpii, inclusiv anti -Ovoinhibitor (ab193507), anti-Lisozim (ab391) și anti-Avidin (ab6675), au fost achiziționate de la compania Abcam (Cambridge, MA, SUA).