Cardiomiopatia hipertrofică în obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi, rolul de suprimare a furcii

Abstract

Subfamilia Foxo a factorilor de transcripție a furcii, inclusiv Foxo1 (FKHR), Foxo3a (FKHRL-1) și Foxo4 (AFX), este o țintă din aval a Akt (20). Fosforilarea Akt are ca rezultat excluderea (inhibarea) nucleară a Foxo. În plus față de răspunsurile celulare bine stabilite provocate de Foxo, incluzând diferențierea, metabolismul, proliferarea, supraviețuirea și atrofia mușchilor scheletici (20, 37), acest factor de transcripție a fost indicat și în atrofia cardiomiocitelor care implică reglarea ascendentă a unei cascade de atrogene (36)., 37, 46). În mușchiul scheletic, atrogenele sunt controlate de reglarea transcripțională mediată de factorul de creștere a factorilor Foxo (35, 37). Recent, s-a demonstrat că factorii de transcripție Foxo sunt exprimați în cardiomiocite sub reglarea factorilor de creștere/semnalizare Akt. Foxo poate controla un program de transcripție atrogenă pentru a regla dimensiunea miocitelor în aval de mai mulți regulatori ai hipertrofiei cardiace (40).

Hrana cu conținut ridicat de grăsimi și parametrii serici.

Evaluarea ecocardiografică.

Geometria și funcția cardiacă au fost evaluate la șoareci anesteziați (Avertin 2,5%, 10 μl/g corp greutate ip) folosind ecocardiografie bidimensională în modul M (Phillips Sonos 5500) echipată cu un traductor liniar de 15-6 MHz (Phillips Medical Systems, Andover, MD). Grosimile peretelui anterior și posterior și dimensiunile diastolice și sistolice ale ventriculului stâng au fost înregistrate din imagini în modul M folosind o metodă adoptată de Societatea Americană de Ecocardiografie. Scurtarea fracțională a fost calculată din diametrul diastolic final (EDD) și diametrul sistolic final (ESD) utilizând ecuația (EDD-ESD)/EDD. Masa estimată a ventriculului stâng ecocardiografic (LV) a fost calculată ca [(LVEDD + grosimea peretelui septal + grosimea peretelui posterior) 3 - LVEDD 3] × 1,055, unde 1,055 (mg/mm 3) este densitatea miocardului. Ritmul cardiac a fost calculat în medie pe 10 cicluri cardiace (14).

Izolarea cardiomiocitelor.

După sedarea ketaminei/xilazinei, inimile au fost îndepărtate și perfuzate cu tampon bicarbonat Krebs-Henseleit conținând (în mM) următoarele: 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 10 HEPES și 11,1 glucoză. Inimile au fost digerate cu colagenază D timp de 20 de minute. Ventriculele stângi au fost îndepărtați și tocați înainte de a fi filtrate. Randamentul miocitelor a fost de ~ 75%, ceea ce nu a fost afectat de alimentația bogată în grăsimi. Doar miocitele în formă de tijă cu margini limpezi au fost selectate pentru studiul mecanic și intracelular Ca 2+ (12).

Scurtarea și întărirea celulelor.

Proprietățile mecanice ale cardiomiocitelor au fost evaluate utilizând un sistem cu margini moi IonOptix (IonOptix, Milton, MA). Miocitele au fost plasate într-o cameră montată pe stadiul unui microscop Olympus IX-70 și superfuzate (± 2 ml/min la 25 ° C) cu un tampon de bicarbonat Krebs-Henseleit conținând 1 mM CaCl2. Miocitele au fost stimulate în câmp la 0,5 Hz, dacă nu se specifică altfel. Scurtarea și întărirea celulelor au fost evaluate, inclusiv scurtarea maximă (PS) - contractilitatea maximă; time-to-PS (TPS) - durata contracției; întărirea timpului până la 90% (TR90) - durata relaxării; și viteze maxime de scurtare/întărire (± dL/dt) - și dezvoltarea și declinul presiunii maxime (12).

Tranzitori intracelulari Ca 2+.

O cohortă de miocite a fost încărcată cu fura 2-AM (0,5 μM) timp de 10 min, iar intensitatea fluorescenței a fost înregistrată cu un sistem de fotomultiplicator cu fluorescență cu dublă excitație (Ionoptix). Miocitele au fost plasate pe un microscop inversat Olympus IX-70 și au fost realizate printr-un obiectiv Fluor × 40 cu ulei. Celulele au fost expuse la lumina emisă de o lampă de 75 W și au trecut fie printr-un filtru de 360, fie de 380 nm, în timp ce au fost stimulate să se contracte la 0,5 Hz. Emisiile de fluorescență au fost detectate între 480-520 nm, iar schimbarea calitativă a intensității fluorescenței fura 2 (FFI) a fost dedusă din raportul FFI la cele două lungimi de undă (360/380). Timpul de descompunere a fluorescenței (decădere unică sau bi-exponențială) a fost calculat ca indicator al compensării intracelulare a Ca 2+ (12).

Test Caspase-3.

Activitatea Caspase-3 a fost determinată conform metodei publicate (23). Pe scurt, s-a adăugat 1 ml PBS într-un balon care conține omogenate de țesut ventricular stâng înainte de centrifugare la 10.000 g la 4 ° C timp de 10 min. Supernatantul a fost aruncat și omogenizații au fost lizați în 100 pl de tampon de liză cu celule răcite cu gheață (50 mM HEPES pH 7,4, 0,1% CHAPS, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA și 0,1% NP-40). Testul a fost efectuat pe o placă cu 96 de godeuri, fiecare godeu conținând 30 μl de lizat celular, 70 μl de tampon de testare (50 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 100 mM NaCl, 10 mM DTT și 1 mM EDTA) și 20 μl de substrat colorimetric caspază-3 Ac-DEVD-pNA (Sigma). Placa cu 96 de godeuri a fost incubată la 37 ° C timp de 1 oră, timp în care caspaza din probă a fost lăsată să scindeze cromoforul p-NA din molecula substratului. Absorbția a fost detectată la 405 nm, activitatea caspazei-3 fiind proporțională cu reacția de culoare. Conținutul de proteine ​​a fost determinat folosind metoda Bradford. Activitatea caspazei-3 a fost exprimată ca picomoli de pNA eliberat pe micrograme de proteină pe minut.

Test Caspase-3/7.

Activitatea Caspase-3 și caspase-7 a fost determinată folosind un kit de testare omogenă Apo-ONE caspase-3/7 (Promega, Madison, WI). Caspaza-3 și caspaza-7 sunt membri ai familiei proteazei specifice acidului cisteină aspartic (caspază) care joacă roluri cheie în apoptoză în celulele mamiferelor. Pe scurt, activitățile de caspază-3 și caspază-7 au fost detectate în celulele supuse apoptozei prin clivarea unei rodamine 110, bis--Substrat al amidei acidului CBZ-1-aspartil-1-glutamil-1-valil-1-aspartic (Z-DEVD-R110), care există ca substrat profluorescent înainte de testare. Pentru a efectua testul Apo-ONE caspase-3/7, am amestecat și adăugat un tampon caspase-3/7 și substratul Z-DEVD-R110 la omogenizările de țesut ventricular stâng. După scindarea secvențială și îndepărtarea peptidelor DEVD prin activitatea caspazei-3 și caspazei-7, grupul părăsit R110 va deveni intens fluorescent la o lungime de undă de excitație de 499 nm și o lungime de undă de emisie de 521 nm. Activitatea caspazei-3 și caspazei-7 a fost direct proporțională cu fluorescența R110 și a fost exprimată ca fluorescență netă (2).

Transfecție Foxo3a dominantă-negativă ex vivo și analiză Western blot.

Extracția totală a ARN-ului, sinteza ADNc, transcrierea inversă și PCR în timp real.

Analiza datelor.

Datele sunt mijloace ± SE. Comparația statistică a fost efectuată de ANOVA urmată de teste post hoc Newman-Keuls. Semnificația a fost stabilită ca

cardiomiopatia

FIG. 1.Efectul hrănirii dietei grase asupra apoptozei în ventriculii stângi ai șoarecilor din grupurile cu restricție alimentară cu conținut scăzut de grăsimi, cu conținut ridicat de grăsimi și cu conținut ridicat de grăsimi (controlul greutății). A: activitate caspase-3. : activitate capsază-3/7. Datele sunt mijloace ± SE; = 5-6 șoareci per grup. *

tabelul 1. Parametrii biometrici și ecocardiografici ai șoarecilor hrăniți cu o dietă scăzută sau bogată în grăsimi timp de 6 luni

Controlul în funcție de greutate este o restricție alimentară bogată în grăsimi. EDD, diametru end-diastolic; ESD, diametru sistolic final; VS, ventricular stâng. Datele sunt mijloace ± SE; = nu. de animale.

* † 2+ proprietăți.

Obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi a fost însoțită de o creștere semnificativă a secțiunii transversale a cardiomiocitelor, redusă ± dL/dt, și TPS și TR90 prelungite cu PS normal (Fig. 2), oarecum amintește de constatările noastre anterioare (33). În plus, cardiomiocitele de la șoareci obezi cu conținut ridicat de grăsimi au prezentat o creștere semnificativă a valorii inițiale a Ca 2+ intracelulară, creșterea depresivă a Ca 2+ intracelulară ca răspuns la stimulul electric (rateFFI) și o rată de decadere intracelulară Ca 2+ redusă (fie unică, fie bi-exponențială potrivirea curbei; Fig. 3). Aceste cardiomiocite mecanice și defecte intracelulare Ca 2+ asociate cu obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi au fost semnificativ atenuate de manevra de control al greutății. Cu toate acestea, restricția alimentară a dietei cu conținut ridicat de grăsimi a prelungit ușor, dar semnificativ TR90 și descompunerea intracelulară ca 2+ ca intracelulară, fără a afecta alți indici (Fig.F și 3D).