BRI2 (ITM2b) inhibă depunerea Aβ in vivo
Jungsu Kim
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Victor M. Miller
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Leviți Yona
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Karen Jansen West
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Craig W. Zwizinski
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Brenda D. Moore
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Fredrick J. Troendle
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Maralyssa Bann
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Christophe Verbeeck
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Robert W. Price
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Lisa Smithson
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Leilani Sonoda
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Kayleigh Wagg
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Vijayaraghavan Rangachari
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Fanggeng Zou
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Steven G. Younkin
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Neill Graff-Radford
2 Neurologie, Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic Jacksonville, Jacksonville, Florida 32224
Dennis Dickson
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Terrone Rosenberry
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Todd E. Golde
Departamentele 1 Neuroștiințe și
Abstract
Analizele efectelor biologice ale mutațiilor în genele BRI2 (ITM2b) și ale proteinelor β precursoare amiloide (APP) susțin ipoteza că acumularea cerebrală de peptide amiloidogene în demențele familiale britanice și familiale daneze și boala Alzheimer (AD) este asociată cu neurodegenerarea. Am folosit tehnologia transgenică a creierului somatic pentru a exprima transgenele BRI2 și BRI2-Aβ1–40 în modelele de șoarece APP. Exprimarea BRI2-Aβ1-40 imită efectul supresiv observat anterior folosind metode transgenice convenționale, validând în continuare metodologia transgenică a creierului somatic. În mod neașteptat, găsim, de asemenea, că expresia BRI2 umană de tip sălbatic reduce depunerea cerebrală Aβ într-un model de șoarece AD. Date suplimentare indică faptul că peptida 23 aa, Bri23, eliberată din BRI2 prin procesare normală, este prezentă în LCR uman, inhibă agregarea Ap in vitro și mediază efectul său anti-amiloidogen in vivo. Aceste studii demonstrează că BRI2 este un nou mediator al depunerii Aβ in vivo.
Introducere
Materiale și metode
rAAV1 construcție și pregătire.
RAAV1 care exprimă BRI2, BRI2-Aβ1-40, BRI2del244-266, fragment variabil nespecific cu lanț unic (scFv ns) sau proteină fluorescentă verde îmbunătățită (eGFP), sub controlul stimulatorului citomegalovirusului/promotorului β actinei (CBA) au fost generate de transfecția de calciu-fosfat a pAM/CBA-pI-WPRE-BGH, rAAV1 cis-plasmid pH21 (AAV1 helm plasmid) și pFΔ6 într-o linie celulară HEK293. Construcția rAAV1-scFv ns a fost raportată anterior (Levites și colab., 2006b). La 48 de ore după transfecție, celulele au fost lizate în prezență de 0,5% deoxicolat de sodiu și 50 U/ml benzonază (Sigma) prin runde repetate de îngheț/decongelare la -80 ° C și -20 ° C. Virusul a fost izolat folosind un gradient discontinuu de iodixanol și apoi purificat prin afinitate pe o coloană HiTrap HQ (GE Healthcare). Probele au fost eluate din coloană și tampon schimbat la PBS folosind un dispozitiv de centrifugare Amicon Ultra 100 (Millipore). Titrul genomic al fiecărui virus a fost determinat prin PCR cantitativă folosind ABI 7900 (Applied Biosystems). Probele de ADN viral au fost preparate prin tratarea virusului cu DNază I (Invitrogen), prin inactivarea căldurii a enzimei și apoi digerarea stratului proteic cu Proteinaza K (Invitrogen), urmată de o a doua inactivare termică. Probele au fost comparate cu o curbă standard de plasmidă supraînfășurată.
injecție rAAV1 la șoareci neonatali.
Cuantificarea depunerii amiloide.
Hemibrainele au fost imersate fixate în 10% formalină apoi prelucrate pentru încorporarea parafinei. Secțiunile de țesuturi cerebrale (5 μm) au fost imunizate cu anticorpul anti-total Aβ [33.1.1; 1: 1000 (Levites și colab., 2006a)] pe un autostainer DAKO. Sarcina plăcii corticale Aβ și numărul de plăci Thio S-pozitive au fost cuantificate așa cum s-a raportat anterior (Kim și colab., 2007). Au fost analizate trei până la șase secțiuni sagitale per creier, la distanță de 50 μm.
Sandwich Aβ ELISA.
Pentru ELβ Aβ cerebrale de la șoareci TgCRND8, hemi-forebrainele au fost omogenizate în SDS 2% cu 1 × amestec inhibitor de protează (Roche) dizolvat în H2O și apoi ultracentrifugat la 100.000 × g timp de 1 oră. Peptidele Ap insolubile în SDS au fost extrase folosind 70% acid formic (FA). Pentru ELβ Aβ cerebrale de la șoareci Tg2576 în vârstă de 2 luni, hemi-forebrainele au fost omogenizate în tampon de test radioimunoprecipitare (0,1% SDS, 0,5% deoxicolat, 1% Triton X-100, 150 mm NaCl și 50 mm Tris-HCl) și apoi ultracentrifugat la 100.000 × g timp de 1 oră. Pentru a măsura nivelurile endogene de Aβ la șoareci, hemi-forebrains ale coșmarilor netransgenici ai șoarecilor TgCRND8 care exprimă BRI2 au fost omogenizați în tampon dietilaminic 0,2% conținând 50 m m NaCI și 1 × amestec inhibitor de protează (Roche). Nivelurile endogen de Aβ de șoarece au fost măsurate utilizând sistemul ELISA Aβ specific pentru rozătoare validat anterior, așa cum sa raportat anterior (Eckman și colab., 2006). Pentru analiza Aβ plasmatică, sângele a fost colectat în tuburi acoperite cu EDTA după puncție cardiacă. Probele de sânge au fost centrifugate la 3000 rpm timp de 10 minute la 4 ° C, iar apoi plasma a fost alicotată și depozitată la -80 ° C până la utilizare. Nivelurile de Aβ au fost determinate de ELISA-uri tip sandwich Aβ uman, după cum s-a descris anterior (Kim și colab., 2007).
Șoarece anti-Aβ IgG ELISA.
Pentru a testa dacă șoarecii generează răspunsuri anticorp anti-Aβ, titrurile anticorpilor anti-Aβ IgG au fost determinate prin tehnici ELISA standard, așa cum s-a descris anterior (Das și colab., 2001). Pe scurt, plăcile de microtitrare (Maxi Sorp; Dynatech) au fost acoperite cu Aβ42 agregat la 2 μg/godeu. După spălări, s-au adăugat diluții plasmatice seriale (diluție 1: 500) și s-au incubat peste noapte la 4 ° C. După spălări cu PBS/0,1% Tween 20, IgG plasmatică a fost detectată folosind un anticorp IgG anti-șoarece conjugat cu HRP (1: 2000; Sigma) și substrat TMB (KPL).
Western blot.
Eșantioanele de creier anterior congelate rapid au fost omogenizate în tampon SDS 2% cu un amestec de inhibitori de protează 1 × (Roche). Omogenatul a fost centrifugat la 100.000 × g timp de 1 oră la 4 ° C. Concentrația de proteine în supernatante a fost determinată folosind kitul de testare a proteinei BCA (Pierce). Probele de proteine (20 μg) au fost rulate pe geluri Bis-Tris 12% XT (Bio-Rad) cu tampon XT-MES sau geluri Bis-Tris 4-12% XT (Bio-Rad) cu tampon XT-MOPS și transferate la 0,2 μm membrane nitrocelulozice. Bloturile au fost microundate timp de 2 minute în 0,1 m PBS de două ori și sondate cu anticorpul 82E1 (anti-Aβ1-16; 1: 1000; IBL), CT20 (anti-APP C-terminal 20 aa; 1: 1000; TE Golde) și ITM2b (GenWay). Bloturile au fost dezbrăcate și reprobate cu anti-actină β (1: 1000; Sigma) ca control de încărcare. Intensitatea relativă a benzii a fost cuantificată utilizând software-ul ImageJ (NIH).