Administrarea intravenoasă a celulelor stromale mezenchimale multipotente derivate din măduva osoasă are o

ARTICOLE DE CERCETARE

Administrarea intravenoasă de celule stromale mezenchimale multipotente derivate din măduva osoasă are un efect neutru asupra cardiomiopatiei diabetice induse de obezitate

Sebastián D. Calligaris și Paulette Conget

Institutul de Științe, Facultatea de Medicină, Clinica Alemana, Universitatea Desarrollo, Santiago, Chile.

Obezitatea este o problemă majoră de sănătate la nivel mondial. Pacienții obezi dezvoltă sindrom metabolic, care este un grup de caracteristici clinice caracterizate prin rezistență la insulină și dislipidemie. Manifestarea sa cardiacă, cardiomiopatia diabetică, duce la insuficiență cardiacă.
Celulele stromale mezenchimale multipotente derivate din măduva osoasă, denumite și celule stem mezenchimale (MSC) sunt concepute ca un instrument terapeutic nu numai pentru bolile cardiovasculare, ci și pentru alte afecțiuni degenerative.
Scopul nostru a fost de a evalua dacă administrarea intravenoasă de MSC modifică disfuncția cardiacă la șoarecii obezi. În acest scop, șoarecii C57BL/6 au fost hrăniți cu o dietă obișnuită (normală) sau bogată în grăsimi (obezi). Animalele obeze au primit vehiculul (obez), o doză unică (obeză + 1x MSC) sau trei doze (obeză + 3x MSC) de 0,5x10 6 MSC simgenic. La două până la trei luni după administrarea MSC, funcția cardiacă a fost evaluată prin cateterizare cardiacă, la starea bazală și după un stres farmacologic.
Comparativ cu șoarecii normali, șoarecii obezi au prezentat hiperglicemie, hiperinsulinemie, hipercolesterolemie și disfuncție cardiacă după starea de stres. MSC exogen nu a îmbunătățit și nici nu a afectat această disfuncție cardiacă.
Astfel, administrarea intravenoasă de MSC are un efect neutru asupra cardiomiopatiei diabetice induse de obezitate

Termeni cheie: Obezitate, sindrom metabolic, cardiomiopatie diabetică, celule stromale mezenchimale multipotente, funcție cardiacă, dobutamină.

INTRODUCERE

Obezitatea este o problemă majoră de sănătate la nivel mondial (Haidar și Cosman, 2011). Modificările stilului de viață, ingestia predominant de dietă hipercalorică și obiceiurile sedentare, produc o creștere dramatică a prevalenței sale. Majoritatea pacienților obezi dezvoltă sindrom metabolic, un grup de caracteristici clinice caracterizate prin rezistență la insulină și dislipidemie (Bonora și colab., 2003). Această afecțiune pre-diabetică a fost recunoscută ca un factor de risc independent pentru bolile cardiovasculare, în special hipertensiunea arterială, ateroscleroza și cardiomiopatia diabetică (Obunai și colab., 2007).

Cardiomiopatia diabetică a fost descrisă în 1972 ca insuficiență cardiacă fără semne de hipertensiune arterială, boală coronariană sau boală cardiacă valvulară sau congenitală (Rubler și colab., 1972). În ultimul deceniu a câștigat relevanță deoarece duce la insuficiență cardiacă (Asghar și colab., 2009); fiziopatologia sa nu este încă bine înțeleasă. Cu toate acestea, s-a raportat că acumularea de lipide a cardiomiocitelor le modifică metabolismul energetic, crescând stresul oxidativ, afectând manipularea calciului și disfuncția mitocondrială, care promovează moartea cardiomiocitelor și fibroza interstițială (Boudina și Abel, 2010). În prezent, tratamentele clinice pentru cardiomiopatia diabetică vizează întârzierea progresiei acesteia, în principal prin îmbunătățirea modificărilor metabolice utilizând agenți hipoglicemianți și a performanței cardiace utilizând blocanți β și inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei (Miki și colab., 2013). Prin urmare, noile terapii destinate inversării insuficienței cardiace la ambii indivizi ar avea un impact semnificativ asupra sistemului de sănătate (Bernardi și colab., 2012).

MATERIALE ȘI METODE

Șoarecii masculi C57BL/6 au fost adăpostiți la temperatură constantă (22 ± 2 ° C) și umiditate (60%), cu un ciclu de lumină 12:12 ore: întuneric și acces nerestricționat la alimente și apă. La cerere, animalele au fost ușor anesteziate cu sevofluoran (Abbott Laboratories, Illinois, SUA) sau 60 mg/kg ketamină plus 4 mg/kg xilazină. Când au fost sacrificate, animalele au fost profund anesteziate și au primit o supradoză de ketamină/xilazină (60/4 mg/Kg). Protocoalele animale au fost aprobate de Comitetul de Etică al Școlii de Medicină, Clínica Alemana, Universidad del Desarrollo.

Inducerea obezității

Toți șoarecii au fost hrăniți cu o dietă obișnuită până la vârsta de o lună. Apoi au fost ținute la o dietă obișnuită (normală) sau au trecut la o dietă bogată în grăsimi (obezi) până la sfârșitul studiului (16 luni de dietă testată). Dieta obișnuită consta în până la 10 cal% grăsimi, 20 cal% proteine și 70 cal% carbohidrați (Champion SA, Santiago, Chile). Dieta bogată în grăsimi consta în 60 cal% grăsimi, 20 cal% proteine și 20 cal% carbohidrați (D12492, Research Diets Inc., NJ, SUA) (Calligaris și colab., 2013a; Ezquer și colab., 2011).

Cuantificarea glicemiei, insulinei, trigliceridelor și colesterolului

După patru ore de post, s-au recoltat probe de sânge din vena cozii șoarecilor alertați. Nivelurile de glucoză plasmatică au fost determinate cu sistemul glucometru Accu-Chek Performa (Roche Diagnostic, Germania). Nivelurile de insulină plasmatică au fost testate utilizând un kit ELISA de insulină de șoarece cu ultrasunete (Mercodia, Uppsala, Suedia). Nivelurile trigliceridelor și colesterolului plasmatic au fost determinate folosind kituri TG Color GPO/PAP și Colestat (Wiener Lab, Rosario, Argentina), respectiv (Ezquer și colab., 2011).

Evaluarea parametrilor cardiovasculari în condiții bazale și de stres

Șoarecii au fost profund anesteziați și așezați în decubit dorsal pe o placă termoreglată. Temperatura corpului a fost monitorizată folosind un termometru rectal și a fost furnizat oxigen gazos. Parametrii hemodinamici au fost măsurați prin cateterizare cardiacă (Calligaris și colab., 2013b; Lorenz și Robbins, 1997). Cateterul utilizat a fost un senzor de presiune Mikro-Tip SPR-671 (Millar, Houston, SUA) cuplat la un traductor PCU-2000 de presiune/volt (Millar) și conectat la un sistem de achiziție de date PowerLab 4/30 (AdInstruments, Bella Vista, Australia). Pentru evaluarea funcției cardiace în condiții de stres, un tub de plastic PE-10 (Warner Instruments Co, CT, SUA) a fost introdus în vena jugulară, conectat la o pompă KDS-KDS210P (Kdscientific Inc., MA, SUA) și dobutamină a fost perfuzată continuu la 12ng/g/min timp de două minute. Dobutamina este un agonist β-adrenergic cu o afinitate ridicată pentru receptorii β1 exprimați în inimă. Când este administrat sistemic, crește cererea cardiacă, producând stres cardiac. Datele obținute au fost analizate cu ajutorul software-ului LabChart 7Pro (AdInstruments, Bella Vista, Australia).

Izolarea MSC și expansiunea ex vivo

Șoareci femele C57BL/6 de șase până la opt săptămâni au fost sacrificați prin luxație cervicală. Celulele măduvei osoase au fost obținute prin spălarea femurilor și tibiilor cu PBS steril. După centrifugare, celulele au fost resuspendate în alfa-MEM (Gibco, NZ) suplimentat cu 10% ser fetal bovin selectat (Gibco) și 80 ug/ml gentamicină (Laboratorul Sanderson, Chile) și placate la o densitate de 1x106 celule nucleate/cm 2. Celulele neaderente au fost îndepărtate după 72 de ore prin schimbarea suportului. Când focarele au ajuns la confluență, celulele aderente au fost detașate cu 0,25% tripsină, 2,65 mM EDTA (Gibco), centrifugate și subculturate la 7.000 celule/cm2. După două subculturi, celulele aderente au fost caracterizate și transplantate (Ezquer și colab., 2008).

Fenotipul MSC administrat

Deoarece în prezent nu există markeri de consens pentru MSC murin ca și pentru MSC uman (Conget și Minguell, 1999; Dominici și colab., 2006), imunofenotiparea a fost efectuată prin analiză de citometrie în flux după imunocolorare cu anticorpi monoclonali împotriva CD45.2 (FITC-conjugat) de la BD Pharmingen, SUA, CD11b (PE-conjugat), Sca-1 (APC-conjugat) și CD90.2 PE -conjugat), toate din eBioscience, CA, SUA.