Activitate redusă a MTHFD1 la șoareci masculi perturba metabolismul monocarbonic dependent de folatul și colina

Martha S. Field

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Kelsey S. Shields

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Elena V. Abarinov

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Olga V. Malysheva

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Robert H. Allen

4 Departamentul de Medicină și Divizia de Hematologie, Universitatea din Colorado Centrul de Științe ale Sănătății, Denver, CO

Sally P. Stabler

4 Departamentul de Medicină și Divizia de Hematologie, Universitatea din Colorado Centrul de Științe ale Sănătății, Denver, CO

Jessica A. Ash

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Barbara J. Strupp

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Patrick J. Stover

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Marie A. Caudill

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Abstract

Introducere

Gena Mthfd1 codifică o enzimă trifuncțională de metabolizare a folatului, C1-tetrahidrofolat (THF) 5 sintază, care joacă un rol important atât în ​​sinteza nucleotidelor, cât și în ciclul metioninei. Enzima C1THF sintază [denumită în mod obișnuit metilenetetrahidrofolat dehidrogenază 1 (MTHFD1)] conține o activitate de sintetază care catalizează conversia dependentă de ATP a formatului și THF în 10-formilTHF și activitatea ciclohidrolazei care catalizează interconversia 10-formilTHF și 5, 10-metenilTHF și o activitate dehidrogenază care reduce 5,10-metenilTHF la 5,10-metilen THF (1) FIG. 1 ).

Un model de lucru al efectelor metabolice ale deficitului de Mthfd1 asupra metabolismului 1-C mediat de colină și folat. Produsul genei Mthfd1 este C1THF sintază, care conține activități enzimatice FTHFS, MTHFC și MTHFD. „X” indică activități enzimatice care sunt reduse cu 50% în modelul de șoarece Mthfd1 gt/+. Metaboliții în cutie sunt cei care au fost măsurați în acest studiu: o cutie cu două căptușeli indică faptul că metabolitul a fost măsurat în ficat și o cutie cu o singură căptușeală indică faptul că metabolitul a fost măsurat în plasmă. Săgeată mai groasă, proces îmbunătățit prin reducerea activității MTHFD1; săgeată punctată, proces atenuat de activitatea MTHFD1 redusă. AdoHcy, S-adenosilhomocyteine; AdoMet, S-adenosilmetionina; 1-C, 1-carbon; CBS, cistationina β-sintaza; DMG, dimetilglicină; FTHFS, 10-formiltetrahidrofolat sintetaza; GPC, glicerofosfocolină; Hcy, homocisteină; Met, metionină; MTHFC, meteniltetrahidrofolat ciclohidrolază; MTHFD, metilenetetrahidrofolat dehidrogenază; MTHFR, 5,10-metilenetetrahidrofolat reductază; PC, fosfatidilcolină; SHMT, serin hidroximetiltransferază; THF, tetrahidrofolat.

Un produs al reacțiilor catalizate de sintază C1THF, 5,10-metilenTHF, există într-un punct ramificat în calea metabolică a folatului. 5,10-MetilenTHF este un donator de 1-carbon (1-C) pentru sinteza de novo a timidilatului sau alternativ poate fi redus ireversibil la 5-metilTHF de enzima 5,10-metilenetetrahidrofolat reductază (1). 5-MethylTHF este un donator de metil cheie pentru remetilarea homocisteinei la metionină, o reacție care este redundantă funcțional cu betaina: conversia catalizată de homocisteină metiltransferază a homocisteinei în metionină (2-4). Atât metabolismul 1-C mediat de folat, cât și degradarea colinei pot furniza în mod independent unități 1-C pentru remetilarea homocisteinei și, prin urmare, aceste 2 căi sunt strâns corelate. În consecință, modificările stării fie a folatului, fie a colinei pot duce la modificări proporționale ale stării celuilalt nutrient, așa cum se arată în mai multe modele de rozătoare (5-8) și studii la om (9-11).

Scopul principal al studiului actual a fost de a cuantifica efectele genotipului Mthfd1 gt/+ asupra biomarkerilor metabolismului colinei. Deoarece studiul nostru anterior a folosit o dietă deficitară atât în ​​folat cât și în colină, studiul actual a încercat să exploreze implicațiile perturbării Mthdf1 asupra metabolismului 1-C în condiții de deficit de folat alimentar numai.

Materiale și metode

Șoareci și diete experimentale.

Toate protocoalele de studiu au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Cornell și sunt conforme cu Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Șoarecii de studiu au fost generați prin încrucișarea șoarecilor femele C57Bl/6 la șoareci masculi 129P2/OlaHsd Mthfd gt/+. Șoarecii C57Bl/6 Mthfd1 gt/+ au fost descriși anterior (12). La înțărcare, descendenții masculi au fost repartizați aleatoriu fie la o dietă AIN-93G (22) (dietă de control, Dyets) care conținea 2 mg/kg acid folic, fie la o dietă AIN-93G modificată lipsită de acid folic [deficient de folat (FD) dietă, Dyets]. Toți șoarecii au fost hrăniți cu dietele respective pentru 5 săptămâni după înțărcare. Șoarecii experimentali au fost genotipați așa cum s-a descris în altă parte (12).

Recoltarea țesuturilor.

Șoarecii au fost uciși prin dislocare cervicală după 12 ore de lipsă de alimente. Sângele a fost colectat prin puncție cardiacă în tuburi acoperite cu heparină. Plasma a fost separată prin centrifugare și congelată în azot lichid. Probele de ficat au fost clătite cu PBS și congelate rapid în azot lichid, apoi depozitate la -80 ° C înainte de analiza colinei.

Analiza metaboliților plasmatici.

Homocisteina plasmatică totală, cistationina, cisteina totală, metionina, serina, glicina, acidul α-aminobutiric, N, N-dimetilglicina și N-metilglicina au fost analizate prin cromatografie de gaz capilar cu diluție stabilă a izotopilor-MS, așa cum s-a descris anterior (23, 24).

Analiza metaboliților colinei hepatice.

Cromatografia lichidă-MS a fost utilizată pentru măsurarea colinei libere, betainei și dimetilglicinei (25), precum și a fosfatidilcolinei, lizofosfatidilcolinei, sfingomielinei, fosfocolinei și glicerofosfocolinei (26) cu modificări pe baza instrumentelor noastre (11).

analize statistice.

Analiza statistică a fost efectuată utilizând un ANOVA cu 2 căi cu interacțiuni de interes incluse în modelul inițial (JMP, Institutul SAS). Efectele au fost considerate semnificative la P ≤ 0,05.

Rezultate

Genotipul Mthfd1gt/+ este asociat cu colină hepatică mai mare, betaină și dimetilglicină.

Așa cum se arată în tabelul 1, genotipul Mthfd1 gt/+ a fost asociat cu concentrații mai mari de colină, betaină și dimetilglicină în țesutul hepatic. Ficatul șoarecilor Mthfd1 gt/+ a avut colină cu 95% mai mare (P = 0,005), precum și dimetilglicină cu 50% mai mare (P = 0,004) și betaină (P = 0,013) față de șoarecii Mthfd1 +/+. Șoarecii Mthfd1 gt/+ au avut, de asemenea, concentrații cu 43% mai mici de glicerofosfocolină hepatică (P = 0,002) decât șoarecii Mthfd1 +/+ (Tabelul 1). În special, dieta FD nu a deranjat metaboliții colinei hepatice la șoarecii Mthfd1 +/+ sau Mthfd1 gt/+ și nici nu au fost detectate interacțiuni genetice (P> 0,10) (Tabelul 1).

TABELUL 1

Metaboliți hepatici ai colinei la șoareci +/+ gt/+ după 5 săptămâni de consum al controlului sau al dietei FD 1

+/+			gt /+			Valoarea efectului P
Metaboliți	Control	FD	Toate	Control	FD	Toate	Dietă	Genotip
n	10	10	20	10	10	20
Colină, nmol/g	346 ± 273	248 ± 189	299 ± 236	621 ± 195	552 ± 289	585 ± 245	ns	0,005
Betaină, nmol/g	418 ± 202	331 ± 180	376 ± 192	618 ± 138	563 ± 262	589 ± 209	ns	0,013
Dimetilglicină, nmol/g	38 ± 13	38 ± 12	38 ± 13	54 ± 14	54 ± 15	54 ± 12	ns	0,004
Glicerofosfocolina, nmol/g	173 ± 77	225 ± 137	198 ± 110	99 ± 22	125 ± 27	113 ± 28	ns	0,002
Fosfocolina, nmol/g	409 ± 215	425 ± 287	417 ± 245	409 ± 176	268 ± 87	335 ± 151	ns	ns
Fosfatidilcolină, μmol/g	17,2 ± 2,75	17,1 ± 2,22	17,1 ± 2,44	17,2 ± 1,87	17,5 ± 0,97	17,4 ± 1,43	ns	ns
Sfingomielină, nmol/g	567 ± 178	626 ± 151	595 ± 164	738 ± 125	657 ± 175	695 ± 155	ns	0,05
Lizofosfatidilcolină, nmol/g	506 ± 152	498 ± 142	502 ± 144	523 ± 118	570 ± 112	548 ± 114	ns	ns

---