Acizii nucleici sferici pe bază de ARNsi inversează vindecarea rănilor afectate la șoarecii diabetici prin gangliozidă

Contribuit de Chad A. Mirkin, 25 martie 2015 (trimis spre examinare 13 februarie 2015; revizuit de Dean Ho și Wei Li)

nucleici

Semnificaţie

Pacienții diabetici suferă adesea de vindecarea rănilor afectată, care se poate transforma în ulcere diabetice care nu vindecă, facilitează infecțiile bacteriene și necesită amputarea. Strategiile actuale pentru tratament nu au reușit să atingă eficacitatea anticipată și nu abordează anomaliile moleculare fundamentale care împiedică închiderea eficientă a plăgii. În această lucrare, introducem o abordare neidentificată anterior pentru tratarea vindecării rănilor diabetice prin utilizarea acizilor nucleici sferici administrați local pentru a efectua eliminarea acidului gangliozidic-monosialic 3 (GM3) sintază, un mediator al vindecării rănilor afectate, la șoarecii diabetici de tip 2 Pe lângă punerea bazelor pentru dezvoltarea unei terapii pentru o afecțiune debilitantă, această lucrare validează și rolul critic al GM3 în vindecarea rănilor diabetice.

Abstract

Din 27 de milioane de americani diagnosticați cu diabet de tip 2 (T2D), mai mult de 6 milioane au răni cutanate cronice, care nu se vindecă, în special pe suprafața plantară, ducând la infecții bacteriene secundare și costând sistemului de sănătate mai mult de 25 miliarde de dolari (1, 2) . Numai în 2010, peste 70.000 de indivizi din Statele Unite cu T2D au suferit amputare (3). Sunt necesare o mai bună înțelegere a patologiei rănilor diabetice și noi intervenții pentru vindecarea rănilor afectate.

Rezultate

GM3S SNA Sinteza și caracterizarea.

După screeningul inițial al oligomerilor vizați GM3S (Fig. S1 și Tabelul S1) prin transfecție convențională de acid nucleic mediată de DharmaFECT1, cele mai bune cinci ARNsi cu knockdown> 70% au fost conjugate cu nanoparticule de aur pentru a produce SNA. Dintre acestea, două SNA au avut secvențe de oligonucleotide cu omologie perfectă între șoareci și GM3S uman și au prezentat o reducere> 75% atât a șoarecilor cât și a GM3S umană. Cea mai eficientă dintre aceste două, SNA 804 (GM3S SNA), a fost aleasă pentru toate studiile terapeutice (vezi mai jos).

SNA-urile au avut un miez de nanoparticule de aur cu diametrul de 13 ± 1 nm la care catena de sens a siARN-ului duplex a fost atașată printr-o legătură propiltiol. Suprafața rămasă a aurului a fost umplută cu oligoetilen glicol tiolat, care funcționează ca agent pasivant și oferă stabilitate suplimentară particulei în soluții biologice (Fig. 1A) (13, 14). Analizele EM de difuzare și transmisie dinamică a luminii au indicat că SNA GM3S avea un diametru mediu hidrodinamic de 28 ± 3 nm și a rămas dispersat în soluție (Fig. 1B). SNA GM3S a avut o încărcare medie de ARNsi de 40 ± 5 duplexuri de ARNsi pe particulă și fiecare duplex siARN de pe SNA a rămas hibridizat și stabil în soluție mai mult de 75 de zile (Fig. 1C). Luate împreună, aceste date indică faptul că nanoparticulele SNA GM3S sunt suficient de robuste, stabile și omogene pentru testarea aplicațiilor in vitro și in vivo.

Reprezentarea și caracterizarea SNA. (A) SNA-urile sunt miezuri de aur de 13 nm dens funcționalizate cu duplexuri siRNA tiolate foarte orientate, care vizează GM3S. Suprafața SNA este pasivată cu oligoetilen glicol pentru stabilitate coloidală. (B) Difuzarea dinamică a luminii confirmă că diametrul hidrodinamic este de ~ 32 nm. (C) Aproximativ 40 de duplexuri siRNA sunt ancorate la fiecare nanoparticulă de aur, iar cuantificarea peste 75 d arată că numărul duplexurilor siRNA complete rămâne statistic identic în acea perioadă de timp. Datele de stabilitate sunt reprezentate ca mijloace ± SD.

Spre deosebire de KC-urile imortalizate (mKC) tratate cu SNA netratate (NT) și fără sens (NS), SNA GM3S a redus atât ARNm GM3S, cât și proteina cu> 80% la o concentrație de 5 nM pe baza concentrației particulelor de aur și echivalentă cu 200 nM siRNA liber, deoarece R40 duplex siARN înconjoară nanoparticulele centrale). Knockdown a avut loc într-un mod dependent de doză (Fig. 2 A și B). În mKC epidermice primare, 2,5 nM GM3S SNA au doborât mARN-ul GM3S și proteinele cu 79% și, respectiv, 88%. Imunofluorescența confocală a șoarecilor imortalizați (Fig. 2C) și a KC-urilor umane (Fig. S2) cu anticorp anti-GM3 a confirmat eliminarea aproape completă a expresiei gangliozidelor GM3 după 72 de ore de tratament cu GM3S SNA. GM3S SNA a fost netoxic pentru mKC la toate concentrațiile testate, care a fost evaluat printr-un test de viabilitate a celulei de excludere în albastru tripan, inclusiv la concentrații de siRNA toxice pentru> 95% din mKC atunci când au fost tratați cu siRNA liber livrat cu reactivul de transfecție DharmaFECT1 (Fig. 2D).

GM3S SNA epuizează GM3S in vivo prin calea RNAi.

Aplicarea topică a GM3S SNA previne vindecarea întârziată a rănilor la șoarece DIO. (A) Imagini clinice reprezentative ale rănilor. (B) Măsurătorile computerizate ale zonei deschise a plăgii au fost efectuate folosind ImageJ (n = 8 răni pe zi și grup de tratament). ** colorarea P +) au fost măsurate prin morfometrie computerizată. Au fost analizate cel puțin șase secțiuni pentru fiecare grup de tratament (n = 6). Datele afișate sunt mijloace ± SE. * P ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –31). SNA-urile siARN sunt constructe unice, foarte anionice, care nu necesită modificări chimice suplimentare pentru a facilita transportul prin stratul cornos sau intrarea în celule. Construcțiile SNA s-au dovedit a fi extrem de eficiente și nu prezintă toxicitate aparentă în aplicațiile de reglare a genelor in vivo (17, 18), inclusiv în acest studiu cu șoareci diabetici. În ciuda absenței unei bariere epidermice la nivelul plăgii în sine, eșecul GM3S siRNA liber de a îmbunătăți vindecarea rănilor sugerează că capacitatea SNA GM3S de a traversa bariera epidermică la marginea plăgii și de a-și doborî ținta joacă un rol important în accelerarea regională Migrația și proliferarea KC.