Acidul trans-retinoic ameliorat ateroscleroza indusă de dietă bogată în grăsimi la iepuri prin inhibarea
1 Departamentul de Cardiologie, Primul Spital Afiliat al Anhui Medical University, Anhui 230022, China
2 Departamentul de hematologie, al doilea spital afiliat al Anhui Medical University, Anhui 230601, China
3 Laborator de biologie moleculară, Anhui Medical University, Anhui 230032, China
Abstract
fundal. Toate-trans-acidul retinoic (atRA) este eficient pentru multe boli proliferative. Am investigat efectele protectoare ale atRA împotriva aterosclerozei. Metode. Iepurii au fost alocați aleatoriu pentru a primi o dietă bazală sau un HFD timp de 4 săptămâni. Grupul HFD a primit apoi rosuvastatină (3 mg/zi), atRA (5 mg/kg/zi), respectiv același volum de vehicul, pentru următoarele 8 săptămâni. Rezultate. Grupul HFD a prezentat creșteri ale lipidelor plasmatice și ale formării plăcii aortice. Expresia P-selectinei și legarea fibrinogenului pe trombocite sau depunerea pe intima aortei au crescut semnificativ, la fel ca și nivelurile de TNF-α, IL-6 și fibrinogen în plasmă. După 8 săptămâni de tratament cu atRA, a existat o scădere semnificativă a lipidelor plasmatice și îmbunătățirea leziunilor aortice. AtRA a inhibat, de asemenea, expresia legării P-selectinei și fibrinogenului pe trombocite și a depunerii pe intima aortei. Concluzie. AtRA poate ameliora AS indusă de HFD la iepuri prin inhibarea activării și inflamației plachetelor.
1. Introducere
Toate-trans-acidul retinoic (atRA) este o familie de molecule de semnalizare care sunt legate chimic de vitamina A (retinol). AtRA are efecte in vitro puternice asupra unui număr de procese implicate în leziuni și reparații vasculare, cum ar fi modularea proliferării celulelor musculare netede (SMC) și inducerea diferențierii SMC [1-4]. Recent, s-a demonstrat că atRA limitează restenoza după angioplastia cu balon la un model de iepure [5], precum și efecte favorabile în reducerea masei neointimale și provocarea remodelării geometrice în artera carotidă a șobolanului rănit [6]. Cu toate acestea, până în prezent nu există rapoarte cu privire la rolul său în ateroscleroza indusă de dietă bogată în grăsimi (HFD).
Prezentul studiu a fost întreprins pentru a investiga posibilele efecte terapeutice ale atRA asupra AS indusă de HFD, cu un accent special pe potențialul său de a inhiba activarea trombocitelor, de a preveni inflamația și de a reduce lipidele sanguine și de a reduce leziunile aortice, în timp ce rosuvastatina a fost utilizată Control.
2. Metode
2.1. Proceduri pentru animale
Iepurii masculi din Noua Zeelandă (clasa obișnuită) au fost cumpărați de la o instalație experimentală pentru animale din Nanjing, China. Iepurii (
kg) au fost menținute în cuști individuale la temperaturi moderate și condiții de lumină schimbătoare (lumină de 12 ore, întuneric de 12 ore) cu acces la alimente și apă curată. După o perioadă de aclimatizare de 3 zile, iepurii au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri. Grupul de control (
) i s-a administrat o dietă bazală, în timp ce unui alt grup i s-a administrat HFD care conținea 5% untură de porc și 1% colesterol. Patru săptămâni mai târziu, animalele din grupul HFD au fost împărțite în trei grupuri și au primit fie rosuvastatină calcică (3 mg/zi), atRA (5 mg/kg/zi), fie același volum de vehicul prin administrare intragastrică timp de 8 săptămâni (
/ grup). Rosuvastatina și atRA au fost dizolvate cu apă.
La sfârșitul experimentului, iepurii au fost posti timp de 8 ore înainte de anestezie (pentobarbital 3% g/v administrat la 1 ml/kg). Sângele a fost colectat din artera carotidă comună. Iepurii au fost sacrificați, iar aortele au fost îndepărtate cu grijă și tăiate. Țesutul a fost observat și apoi plasat în 10% (greutate/volum) formalină neutră timp de 24 de ore. Procedurile experimentale pe animale au fost efectuate în conformitate cu Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor interne din cadrul Universității medicale Anhui și au respectat Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea laboratorului.
2.2. Reactivi
Rosuvastatin calciu a fost cumpărat de la AstraZeneca; atRA și ADP au fost achiziționate de la Sigma. Trombina a fost achiziționată de la Pharmaceutical Co., Ltd., Hunan. Anticorp anti-iepure CD62-P FITC conjugat a fost achiziționat de la Bioss, Beijing. Anticorpul policlonal anti-fibrinogen de pui (FITC) a fost achiziționat de la Abcam. Kituri SP-9000/9001/9002 Histostain-Plus au fost achiziționate de la ZYMED.
2.3. Colectarea sângelui și pregătirea trombocitelor
Probele de sânge au fost colectate în tuburi care conțin 3,8% citrat de sodiu (1/9 v/v) pentru măsurători biochimice și citometrie în flux. Proba de sânge a fost centrifugată la 1000 g timp de 10 minute pentru a colecta plasma. Plasma bogată în trombocite (PRP) a fost obținută prin centrifugare la 300 g timp de 10 minute. Trombocitele au fost apoi izolate din PRP folosind PBS pentru a se spăla de două ori așa cum s-a descris anterior [13, 17].
2.4. Detectarea expresiei trombocitelor P-Selectin (CD62-P) și a legării fibrinogenului prin citometrie în flux
Trombocitele de repaus și trombocitele activate de trombină (1 U/ml) sau ADP (concentrația finală este de 20 μM) au fost incubate cu CD62P anti-iepure conjugat cu FITC sau fibrinogen timp de 30 de minute la temperatura camerei în întuneric. PBS (0,5 mL) a fost adăugat la probă imediat înainte de achiziționarea datelor. Toate probele au fost analizate prin citometrie în flux prin FC500 (Beckman Coulter), utilizând 10.000 de evenimente pe probă cu dispersie de lumină și canale de fluorescență stabilite la un câștig logaritmic. Populația de trombocite a fost analizată pentru intensitatea medie a fluorescenței (IFM).
2.5. Măsurarea biochimică
Concentrațiile lipidelor plasmatice au fost determinate folosind kituri de testare a enzimei de diagnosticare. Fibrinogen plasmatic, IL-6 și TNF-α au fost măsurate utilizând un fibrinogen de iepure Quantikine, IL-6 și TNF-α set de test imunosorbent legat de enzime (ELISA) (sisteme de cercetare și dezvoltare).
2.6. Morfologie și imunohistochimie
2.7. Analize statistice
Toate analizele statistice au fost efectuate folosind programul SPSS, versiunea 13.0, pentru Windows. Toate datele sunt exprimate ca medie ± deviație standard (SD). Comparațiile între grupuri au fost efectuate folosind analiza unică a varianței (ANOVA) și metoda Student-Newman-Keuls (SNK). Valorile
au fost considerate semnificative statistic.
3. Rezultate
3.1. atRA Lipide plasmatice îmbunătățite la iepurii AS induși de HFD
Comparativ cu grupul martor, creșterea semnificativă a lipidelor plasmatice indusă de HFD, inclusiv colesterolul total (Total-C), colesterolul lipoproteic cu densitate mică (LDL-C), colesterolul cu lipoproteine cu densitate mare (HDL-C) și trigliceridele (TG) . Administrarea orală de rosuvastatină sau atRA a redus în mod semnificativ Total-C și LDL-C și ambele au crescut semnificativ HDL-C în timpul alimentării cu HFD (Tabelul 1). Aceste descoperiri sugerează că intervenția atRA poate ajuta la restabilirea dezechilibrului lipidic indus de HFD.
2 9. 3 7 ± 4. 3 6
2 4. 5 7 ± 4. 5 7
1 6. 2 7 ± 2. 4 0
1 7. 2 4 ± 4. 4 4
1 2. 9 2 ± 3. 1 9
comparativ cu grupul de control; ▲
3.2. plăci arteriale ameliorate atRA la iepuri AS induși de HFD
Caracteristicile leziunilor arteriale au fost examinate prin colorare în secțiune patologică HE folosind microscopie cu lumină. În grupul de control, pereții vasului erau rotunzi, cu grosimi uniforme. Plăcile elastice interioare și exterioare erau clare și complete. Miezul celulei endoteliale a fost colorat și aranjat uniform. Nu s-au văzut SMC sub endoteliu (Figura 1 (a)).