Acidul alfa-lipoic protejează celulele endoteliale aortice umane împotriva leziunilor induse de H2O2 și inhibă
Pixu Liu și Huijun Sun.
Institutul de celule stem canceroase, Universitatea Medicală Dalian
Dalian, 116044 (China)
E-mail [email protected], [email protected]
Articole similare pentru „”
- Leziuni induse de 2O2 și inhibă ateroscleroza la șoarecii knock-out receptori de lipoproteine cu densitate scăzută ovariectomizate - https://www.karger.com/Article/FullText/491537 @KargerPublisher "target =" _ blank "onclick =" javascript: window.open (this.href, '', 'menubar = no, toolbar = no, resizable = yes, scrollbars = yes, height = 400, width = 600'); return false; "title =" Tweet This Page "onclick =" ga 'trimite', 'eveniment', 'FullText', 'Social Media', 'Fix Twitter'); "> Stare de nervozitate
- Leziuni induse de 2O2 și inhibă ateroscleroza la șoareci knock-out cu receptor de lipoproteine cu densitate scăzută ovariectomizată% 0A% 0A https://www.karger.com/Article/FullText/491537 "onclick =" ga ('send', 'event', 'FullText', 'Social Media', 'Fix Email'); "> E-mail
Abstract
Introducere
În ciuda progreselor terapeutice considerabile din ultimele decenii, ateroscleroza rămâne principala cauză de deces la nivel mondial, în special în rândul femeilor aflate în postmenopauză [1, 2]. În comparație cu femeile aflate în premenopauză, femeile aflate în postmenopauză au o incidență mai mare a bolilor cardiovasculare datorită pierderii capacității de reacție la estrogenul intern sau chiar extern [3]. S-a postulat că deficiența de estrogen contribuie la morbiditatea ridicată a aterosclerozei la femeile aflate în postmenopauză printr-un rol în numeroase procese aterogene, incluzând inflamația [4, 5], proliferarea celulară a mușchiului neted vascular [6], generarea de specii reactive de oxigen (ROS) [7] și apoptoza celulelor endoteliale vasculare [8]. Unele studii au demonstrat că terapia de substituție hormonală (HRT) poate reduce riscul bolilor cardiovasculare la femeile aflate în postmenopauză, dar numai atunci când terapia este inițiată în stadiile incipiente după menopauză [9-12].
Multe studii au arătat că inflamația și stresul oxidativ joacă un rol central în progresia aterosclerozei [2, 13, 14]. S-a raportat că stresul oxidativ, ca rezultat al generării excesive de ROS intracelulare, incluzând radicalii hidroxilici (OH -), peroxidul de hidrogen (H2O2) și anionul superoxid (O2 -), joacă un rol cheie în dezvoltarea și progresia aterosclerozei prin promovând disfuncția endotelială, inflamația și peroxidarea lipidelor [15, 16]. Familia de enzime NADPH oxidază (Nox) și subunitățile lor de reglare, inclusiv p22phox, p47phox, Noxa1 și p67phox, sunt surse importante de ROS în vasculatura declanșată de stres, hormoni și agenți vasoactivi. S-a raportat că ROS activează NF-κB [17], care joacă un rol cheie în diferite răspunsuri inflamatorii și imune și este legat de dezvoltarea aterosclerozei [18]. În plus, s-a demonstrat că NF-κB este implicat în reglarea transcripțională a expresiei subunității Nox [19, 20]. Prin urmare, agenții farmacologici care ar putea atenua inflamația și stresul oxidativ prin întreruperea căii NF-κB ar trebui să aibă efecte anti-aterogene.
Estrogenul este implicat direct sau indirect în reglarea răspunsurilor imune, proliferării celulare, inflamației și aderenței celulare [18]. S-a demonstrat că semnalizarea estrogenului reduce dezvoltarea aterosclerozei prin efecte non-genomice rapide și/sau calea clasică prin legarea la receptorii de estrogen (ERα și ERβ) [21-23]. Estrogenul are, de asemenea, proprietăți antioxidante prin inhibarea expresiei Nox și generarea de anion O2 - superoxid [24]. Mai mult, estrogenul își exercită efectele ateroprotectoare legându-se de receptorii săi pentru a genera monoxid de azot în celulele endoteliale, care tinde să aibă o funcție de protecție asupra vaselor de sânge [25-27]. Din păcate, nivelurile de expresie ale receptorilor de estrogen scad în timpul stadiului târziu al menopauzei. Ca urmare, suplimentarea cu estrogen în această etapă nu poate inversa riscul de ateroscleroză [28, 29]. Prin urmare, un agent farmacologic care ar putea promova nivelul receptorilor de estrogen ar aduce beneficii femeilor aflate în postmenopauză prin protejarea împotriva aterosclerozei.
Acidul alfa-lipoic (ALA), cunoscut și sub numele de acid 1,2-ditiolan-3-pentanoic, acid 1,2-ditiolan-3-valeric sau acid tioctic, a fost raportat ca fiind un puternic antioxidant care poate elimina ROS intracelular [30-32]. Mai multe linii de dovezi au arătat că ALA are efecte antiinflamatorii și anti-obezitate împotriva procesului patologic al aterosclerozei [33-35]. Cu toate acestea, mecanismele funcției protectoare ale ALA și efectele sale asupra dezvoltării aterosclerozei postmenopauzale rămân necunoscute.
Materiale și metode
Materiale
Celulele endoteliale aortice umane (HAEC) au fost obținute de la Institutul de Biochimie și Biologie Celulară, Academia Chineză de Științe (Shanghai, China). Mediul de cultură celulară (DMEM, RPMI-1640) și serul bovin fetal (FBS) au fost achiziționate de la Gibco-BRL Co. (Gaithersburg, MD, SUA). ALA (la o puritate de> 99,5%) a fost achiziționată de la Fushilai Medicine & Chemical Co., Ltd. (Changshu, China). Sonda fluorescentă DCFH-DA a fost achiziționată de la Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, China). Kituri de testare a extractului de proteine au fost obținute de la KeyGEN Biotechnology (Nanjing, China). Anticorpii specifici pentru Bcl-2, caspaza-3, ERα, ERβ, ICAM-1, VCAM-1, IκBα, p65 fosforilat (p-p65) și Nox4 au fost obținuți de la Proteintech Group (Wuhan, China) și anticorpi specifici pentru p65, vinculin au fost achiziționate de la Bioworld Technology (Nanjing, China). Inhibitorul NF-PDB PDTC a fost obținut de la Beyotime (Jiangsu, China), iar inhibitorul Nox4 DPI și inhibitorul receptorului de estrogen ICI182, 780 au fost achiziționați de la Sigma (St. Louis, MO, SUA).
Cultură celulară și tratament cu H2O2
HAEC au fost cultivate în DMEM conținând 10% FBS la 37 ° C și 5% CO2. După atingerea confluenței de 60%, HAEC-urile au fost tratate cu concentrații diferite de ALA (75, 150, 300μM) timp de 24 de ore înainte de tratamentul cu H2O2 (1 mM) timp de 4 ore. ALA a fost dizolvat în dimetil sulfoxid.
Analiza Western blot
Colorarea imunofluorescentă
La momentele de diferențiere indicate, celulele cultivate au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) de două ori și fixate cu paraformaldehidă/PBS 4% timp de 10 minute la temperatura camerei. Apoi, celulele au fost permeabilizate cu 0,5% Triton-X/PBS timp de 10 min. După spălare cu PBS, celulele au fost blocate cu 2% ser albumină bovină și incubate peste noapte la 4˚C cu anticorpi primari, inclusiv ERα (Proteintech Group, diluție 1:50) și p65 (Bioworld Technology, 1:50 diluție). Anticorpii secundari, inclusiv IgG anti-iepure conjugat Alexa Fluor 488 (capră, 1: 100, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) au fost utilizați conform instrucțiunilor producătorului. Probele au fost incubate la temperatura camerei timp de 1 oră. După spălare cu PBS și contracolorare cu DAPI, probele au fost montate cu soluție antifade Prolong Gold (Thermo Fisher Scientific). Celulele au fost vizualizate și fotomicrografiile au fost obținute utilizând un microscop vertical cu fluorescență (Olympus, Center Valley, PA, SUA). Cuantificarea intensității fluorescenței a fost efectuată folosind ImageJ. Au fost măsurate cel puțin 50 de celule din trei zone diferite pe cameră.