YY1 specific pentru miofibroblaste favorizează fibroza hepatică
Huan Liu
a Aab Institutul de Cercetare Cardiovasculară, Departamentul de Medicină, Universitatea din Rochester Școala de Medicină și Stomatologie, Rochester, NY, SUA
b Laborator cheie de conservare și întreținere a fertilității Ministerului Educației, Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Școala de Științe Medicale de Bază, Universitatea de Medicină Ningxia, Yinchuan, China
Shuya Zhang
a Aab Institutul de Cercetare Cardiovasculară, Departamentul de Medicină, Universitatea din Rochester Școala de Medicină și Stomatologie, Rochester, NY, SUA
b Laborator cheie pentru conservarea și întreținerea fertilității Ministerului Educației, Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Școala de Științe Medicale de Bază, Universitatea de Medicină Ningxia, Yinchuan, China
Suowen Xu
a Aab Institutul de Cercetare Cardiovasculară, Departamentul de Medicină, Universitatea din Rochester Școala de Medicină și Stomatologie, Rochester, NY, SUA
Marina Koroleva
a Aab Institutul de Cercetare Cardiovasculară, Departamentul de Medicină, Universitatea din Rochester Școala de Medicină și Stomatologie, Rochester, NY, SUA
Eric M. Mic
a Aab Institutul de Cercetări Cardiovasculare, Departamentul de Medicină, Universitatea din Rochester Școala de Medicină și Stomatologie, Rochester, NY, SUA
Zheng Gen Jin
a Aab Institutul de Cercetare Cardiovasculară, Departamentul de Medicină, Universitatea din Rochester Școala de Medicină și Stomatologie, Rochester, NY, SUA
HL, SZ și ZGJ au scris manuscrisul cu comentarii și contribuții de la toți autorii. HL, SZ și MK au efectuat experimente. SX a corectat și revizuit manuscrisul. EMS a furnizat reactivi cheie. ZGJ a conceput studiul. Toți autorii au aprobat versiunea finală a manuscrisului.
Date asociate
Abstract
Fibroza hepatică este o consecință frecventă a diferitelor hepatite cronice și leziuni hepatice. Miofibroblastele, prin acumularea proteinelor din matricea extracelulară (ECM), sunt strâns asociate cu progresia fibrozei hepatice. Cu toate acestea, mecanismele moleculare care stau la baza reglării transcripționale a genelor fibrogene și a proteinelor ECM în miofibroblaste rămân în mare parte necunoscute. Folosind linii de șoarece care exprimă Cre-specific miofibroblastului inductibil cu tamoxifen cu ștergere selectivă a factorului de transcripție Yin Yang 1 (YY1), aici arătăm că ștergerea YY1 din miofibroblaste atenuează fibroza hepatică indusă de tetraclorură de carbon. Acest efect protector al ablației YY1 asupra fibrozei hepatice a fost însoțit de expresia redusă a genelor profibrogene și a proteinelor ECM, inclusiv TNF-α, TGF-β, PDGF, IL-6, α-SMA și Col1α1 în țesuturile hepatice de la șoarecii mutanți YY1. Mai mult decât atât, folosind linia de celule stelate hepatice umane (HSC) LX-2, am constatat că eliminarea YY1 în miofibroblaste prin tratament cu siRNA a diminuat proliferarea miofibroblastelor, expresia α-SMA și depunerea de colagen. Colectiv, descoperirile noastre relevă un rol specific al YY1 în miofibroblastele hepatice și sugerează o nouă strategie terapeutică pentru bolile hepatice asociate fibrozei hepatice.
1. Introducere
Factorul de transcripție Yin Yang 1 (YY1) joacă un rol crucial în diferite procese biologice, inclusiv proliferarea celulară, diferențierea și dezvoltarea [7]. Cu toate acestea, nu este clar dacă YY1 contribuie la activarea miofibroblastelor și la producerea ECM în timpul dezvoltării fibrozei hepatice. Prin utilizarea șoarecilor nou-proiectați postn Cre recombinază indusă de tamoxifen, direcționată spre gena (Postn MCM), pentru șoareci genetici YY1 în miofibroblaste, aici raportăm că ștergerea YY1 specifică miofibroblastului a inhibat formarea miofibroblastelor și a atenuat fibroza hepatică la șoarecii deficienți cu tetrach de carbon).
2. Materiale și metode
2.1. Șoareci și tratamente
Pentru a evalua efectul potențial al deficitului de YY1 la miofibroblaste asupra modelului șoarecilor cu fibroză tratați cu CCL4, șoarecii deficienți YY1 specifici ai miofibroblastelor (YY1 flox/flox, Postn MCM +) au fost generați prin încrucișarea șoarecilor YY1 flox/flox [8] cu Postn MCM + șoareci [9]. Șoarecii knockout condiționati YY1 (YY1 flox/flox) [8] au fost cumpărați de la Jackson Laboratory; Șoarecii Postn MCM + au fost înzestrați de Jeffery D Molkentin [9] (Cincinnati Children's’s Hospital). Șoarecii YX1 flox/flox au fost folosiți ca littermate de tip sălbatic (WT). Flox/flox YY1 de 10 săptămâni; Șoarecii Postn MCM + au fost hrăniți cu o dietă alimentară tamoxifen (Envigo, nr. TD.130857) timp de 8 săptămâni cu CCL4 (Sigma, Nr. Cat.289116 2 μl/g, diluat 1: 4 în ulei de măsline (Sigma, Cat Nr. O1514) injectat o dată pe zi timp de cinci zile. (Total de 12 ori). După opt săptămâni, șoarecii au fost sacrificați sub anestezie 48 de ore după ultima doză de CCL4. Toate studiile la animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Centrul Medical al Universității din Rochester.
2.2. Histologie și imunohistochimie
2.3. Experimente de cultură celulară
Linia de celule stelate hepatice umane (HSC) LX-2 [10] (MilliporeSigma, Nr. Cat. SCC064). Celulele LX-2 au fost cultivate în DMEM High Glucose (Millipore Cat. Nr. SLM-021-B), 2% FBS (Millipore Cat. No. ES009-B), 1% Pen/Strep (Millipore Cat. No. TMS- AB2-C) și 1% glutamină (Millipore Cat. Nr. TMS-002-C) medii. Celulele LX-2 au fost subculturate cu tripsină (Millipore Cat. Nr. SM-2003-C) și apoi trecute înainte de utilizare. Celulele LX-2 au fost stimulate de TGF-β (10 μg/ml; Sigma, Cat Nr. SAB4502958) timp de 24 de ore pentru a se transforma în miofibroblast.
2.4. transfecție siARN
Miofibroblaste la o confluență mai mare de 80% în vase de 60 mm au fost utilizate pentru transfecție. Pe scurt, agentul de transfectare RNAiMax (6 μl; Invitrogen; Cat Nr. 13-778-030) a fost amestecat cu Opti-MEM (250 μl; Invitrogen; Cat No.11-058-021), și apoi siRNA uman YY1 (25 nM, Invitrogen; Cat Nr. AM16708) sau non-target control siRNA (25 nM, Invitrogen; Cat Nr. AM4065) diluat în 250 μl Opti-MEM a fost adăugat la soluție, amestecat ușor și incubat la temperatura camerei timp de 20 min . Un total de 0,5 ml din acest amestec a fost adăugat la MF în 1,5 ml Opti-MEM și incubat timp de patru ore. Apoi, mediul a fost înlocuit cu mediu DMEM complet și celulele au fost tratate după 48 de ore după transfecție [11].
2.5. PCR cantitativ în timp real
După tratament, ARN-ul total a fost extras folosind un kit QIAGEN RNeasy Mini (Qiagen, nr. Cat. 74136) [11]. Concentrația și puritatea ARN au fost determinate de spectrofotometrul Nanodrop2000 (Thermo Fischer Scientific). Pentru transcrierea inversă, 0,5-1 μg de ARN total au fost transformate mai întâi în ADN complementar catenă (ADNc) folosind un kit de transcripție inversă ADNc de mare capacitate (Applied Biosystems, Cat No. 4374966) urmând instrucțiunile producătorului. PCR cantitativă în timp real a fost apoi efectuată cu un ciclor termic PCR în timp real Bio-Rad iQ5, utilizând iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Nr. Cat 1708886) pentru cuantificarea relativă a ARNm. Toate secvențele de exemplu au fost enumerate în Tabelul S1. Metoda comparativă a pragului ciclului (Ct) (2 - ΔΔCt) a fost utilizată pentru a determina expresia relativă a ARNm a genelor țintă după normalizarea genei menajere GAPDH sau β-actină.
2.6. Analiza Western blot
Țesuturile hepatice congelate și lizatele celulare totale au fost recoltate în tampon de liză proaspăt preparat (20 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCI, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2,5 mM pirofosfat de sodiu, 1 mM β-Glicerolfosfat, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4 și 1% inhibitor de cocteil proteazic). După clarificare la 4 ° C, celulele au fost rotite la 12.000 g timp de 10 minute; lizatul celular total a fost colectat pentru analiza gelului SDS-PAGE. După un transfer de 1,5 ore la 250 mV, membranele au fost blocate în tampon de blocare LI-COR diluat 1: 1 cu PBS la temperatura camerei timp de o oră. Apoi, pete au fost incubate cu anticorpi primari (enumerați în Tabelul S2) diluați în 3% BSA la 4 ° C peste noapte sau la temperatura camerei timp de o oră, urmată de incubare cu LI-COR IRDye ® 680RD capră IgG anti-șoarece (H + L) sau IRDye ® 800CW capră anti-iepure IgG (H + L) sau IRDye ® 680RD măgar anti-capră IgG (H + L) (diluare la 1: 10.000) la temperatura camerei timp de 30 min. Imaginile au fost vizualizate folosind un sistem de imagistică cu infraroșu Odyssey (LI-COR) [11]. Analiza densitometriei bloturilor a fost efectuată utilizând software-ul NIH Image J (http://imagej.nih.gov/ij/).