Variantele genei receptorilor melanocortinei-3 în obezitatea morbidă International Journal of Obesity
Abstract
FUNDAL: Studiile de șoareci de legătură și knock-out sugerează că receptorul melanocortinei-3 (MC3R) este o genă candidată pentru obezitate.
OBIECTIV: Pentru a evalua dacă mutațiile MC3R stau la baza obezității morbide.
SUBIECTE ȘI METODE: Codificarea MC3R și regiunile de flancare 5 ′ au fost secvențiate la 48 de subiecți și variantele detectate au fost genotipate la 252 finlandezi cu obezitate morbidă (IMC ≥40 kg/m 2). Schimbările de gel au fost utilizate pentru a examina dacă o mutație în promotorul supus modifică legarea factorului GATA.
REZULTATE: Au fost găsite trei variante comune MC3R: o variantă 17C> A, care schimbă Thr6 → Lys în 16%, o 241G> O variantă care schimbă Val81 → Ile în 15% și o substituție −239A> G în locul de legare GATA în 21% din subiectii. Alte patru variante au fost detectate în regiunea de flancare 5 ′. Frecvențele celor trei variante comune nu au diferit între subiecții obezi și contol. Dintre obezi, variantele 17C> A și 241G> A au fost moștenite și asociate cu un raport crescut insulină-glucoză ( Mutația G.
CONCLUZII: Variantele genei MC3R sunt frecvente și nu explică obezitatea morbidă umană. Aceste variante s-au asociat cu modificări subtile în debutul creșterii în greutate, hiperleptinemie și raporturi insulină - glucoză. Mutația −239A> G elimină legarea GATA-4 la regiunea promotorului MC3R.
Introducere
Proporția de grăsime corporală este reflectată de nivelurile de leptină și insulină circulante, iar homeostazia pe termen lung a greutății corporale se realizează prin integrarea acestor semnale hormonale de către centrele hipotalamice. 1,2,3 Neuropeptidele derivate din precursorul ACTH pro-opiomelanocortina (POMC) și receptorii melanocortinei (MCR) joacă un rol cheie în acest control complex al apetitului și al greutății corporale. 1,2 MC3R și MC4R sunt ambele exprimate în zone creierului implicate în reglarea echilibrului energetic. 2 MC4R joacă un rol important în homeostazia energetică, întrucât întreruperea sa vizată provoacă hiperfagie și obezitate la șoareci. 4 mutații MC4R stau la baza până la 4% din obezitatea severă cu debut precoce sau obezitatea la adulți. 5.6 Legătura observată între obezitate și regiunea cromozomială 20q13 face, de asemenea, gena MC3R o genă candidată plauzibilă pentru obezitatea umană. În plus, întreruperea MC3R la șoareci are ca rezultat creșterea masei grase, hiperleptinemie și rezistență la insulină. 8,9 Am examinat dacă mutațiile genei MC3R stau la baza obezității morbide și/sau sunt asociate cu modificări ale parametrilor metabolici.
Subiecte și metode
Între anii 1989-1995 a fost colectată o cohortă de 252 pacienți obezi morbid (IMC ≥ 40 kg/m 2, 182 femei/70 bărbați, vârsta 21-67 ani, prevalența diabetului zaharat și a hipertensiunii arteriale 24 și respectiv 45%). 10 Istoria dezvoltării greutății a fost evaluată prin chestionar. Pentru detectarea mutației, 1400 pb din regiunea de flanșare 5 ′ și întreaga regiune de codificare a genei MC3R au fost secvențiate la 48 de subiecți, iar variantele detectate au fost genotipate în restul cohortei. Probele de sânge de la 312 de donatori de sânge sănătoși (153 de femei și 159 de bărbați) de la Serviciul finlandez de transfuzie a sângelui de la Crucea Roșie au servit drept controale pentru estimarea frecvențelor de alele în populația de fond. Concentrațiile de leptină au fost determinate prin radioimunotest (Linco Research Inc., St Charles, MO, SUA) cu CV intra și între teste mai mici de 5%. Nivelurile de glucoză, insulină și lipide au fost măsurate așa cum s-a descris anterior. 10
Secvențierea ADN și genotiparea
După PCR, gena MC3R a fost secvențiată folosind perechi de primeri: 5 ′ - IndexTerm TGACCAGAGCAGACTACTTTCA-3 ′ și 5 ′ - IndexTerm TGAGCAAAGACAACAGCCACT-3 ′; 5 ′ - IndexTerm TCTTCTTCCACCCCAGACTC-3 ′ și 5 ′ - IndexTerm GCAAGACAGGGGATGTGTTA-3 ′; 5 ′ - IndexTerm CCCTTGGCCAATATGAAAAA-3 ′ și 5 ′ - IndexTerm CCAGATACGTCTTTTGGATGC-3 ′; 5 ′ - IndexTerm TCTCTACCCTCCCCATCCTT-3 ′ și 5 ′ - IndexTerm GGGCATTGGACACACTTACC-3 ′; 5 ′ - IndexTerm CATCGTCAGTCTGCTGGAAA-3 ′ și 5 ′ - IndexTerm GAGCATCATGGCGAAGAAC-3 ′; și 5 ′ - IndexTerm CTCGGAGAGCACAAATGGTCA-3 ′ și 5 ′ - IndexTerm TCACGTGGATGGAAAGTCAA-3 ′. Secvențierea a fost efectuată utilizând secvențierul ADN ABI Prism 377. Genotiparea variantelor −239A> G, 17C> A și 241G> A au fost efectuate folosind enzime de restricție AlwEu, HpyCH4IV și BseDI, respectiv electroforeză pe gel.
Test de schimbare a mobilității electroforetice (EMSA)
Proteinele nucleare au fost preparate 11 dintr-o celulă tumorală Sertoli de șoarece MSC-1, limfom cu celule T Jurkat și linii de fibroblaste NIH 3T3, exprimând GATA-4 și GATA-6 (MSC-1), GATA-3 (Jurkat) și niciun GATA cunoscut proteine (NIH-3T3). Probele au fost preparate prin recoacerea oligonucleotidelor 5 ′ - IndexTerm TTTCTATGTAAACAAGATAAAAACTGCTCCTCCT-3 ′ (corespunzând nucleotidelor −253 la −220) și 5 ′ - IndexTerm AGGAGGAGCAGTTTTTATCTTGTTTACATAGAAGGATAAAAACTGCTCCTCCT-3 ′ și 5 ′ - IndexTerm AGGAGGAGCA-GTTTTTATCCTGTTTACATAGAAA-3 ′ (MCR3mut, −239A> mutația G subliniată) și 5 ′ - IndexTerm CCCATAAAGATAGGGA-3 ′ și 5 ′ - IndexTerm TCCCTATCTTTATGGG-3 ′ (corespunzător nucleotidelor −182 la −163 ale genei steroidogene -1) . Una dintre oligonucleotidele fiecărei sonde a fost marcată la 5 ′ cu [γ- 32 P] ATP înainte de recoacere. Reacțiile de legare au fost efectuate așa cum este descris. 13 Anticorpii provin de la Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).