Vagotomia reduce eliminarea insulinei la șoarecii obezi programată de o dietă cu conținut scăzut de proteine în adolescență
1 Universitatea din Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazilia
2 Universitatea de Stat din Western Paraná (UNIOESTE), Cascavel, PR, Brazilia
Abstract
1. Introducere
S-a propus că aportul scăzut sau ridicat de calorii de către mame și tați este asociat cu perturbarea homeostaziei glucoză-insulină la descendenții lor [1]. Șoarecii au fost menținuți la o dietă cu conținut scăzut de proteine la începutul vieții și hrăniți cu o dietă de control, în timpul vârstei adulte, și au, de asemenea, o creștere de recuperare asociată cu intoleranța la glucoză [2]. Într-adevăr, îmbunătățirile economice din țările în curs de dezvoltare, în ultimele decenii, au plasat subiecții umani în condiții similare. La acești subiecți, aportul unei diete normale sau bogate în calorii la vârsta adultă, după o perioadă de restricție calorică la începutul vieții, crește riscul de a dezvolta boli metabolice [3, 4]. Aceste situații de mediu timpurii sunt cunoscute sub numele de răspuns adaptiv predictiv sau ipoteză de fenotip economisitoare, postulată de Hales și Barker în 1992 [1].
Am arătat că șoarecii hrăniți cu o dietă săracă în proteine în adolescență, urmată de o dietă bogată în grăsimi în timpul maturității, dezvoltă intoleranță la glucoză, rezistență la insulină și secreție redusă de insulină, comparativ cu cei hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi pe tot parcursul perioadă experimentală [5]. Acest lucru indică faptul că programarea metabolică, indusă de malnutriție la începutul vieții, afectează homeostazia insulinei-glucozei într-o măsură mai mare decât obezitatea în sine. În plus, șoarecii subnutriți și obezi pot prezenta leziuni ale neuronilor hipotalamici, care controlează aportul și cheltuielile de energie [6]. Șoarecii intoleranți la glucoză, expuși la o dietă cu conținut scăzut de proteine la începutul vieții și la o dietă de control la maturitate, prezintă, de asemenea, o activitate vagală crescută, sugerând participarea sistemului nervos parasimpatic la homeostazia glucozei [2].
Programarea metabolică poate fi explicată prin conceptul Originile dezvoltării sănătății și bolilor (DOHaD) care descrie prin mai multe studii modul în care factorii de mediu precoce, cum ar fi nutriția, care pot induce modificări fiziologice la fetali, neonatali, adolescenți și adulți, ducând la programului pentru consecințe postnatale pe termen lung [7-9].
Astfel, am căutat să explorăm efectul vagotomiei subdiafragmatice asupra sensibilității, secreției și degradării insulinei la șoarecii metabolici programați, indusă de o dietă cu conținut scăzut de proteine la începutul vieții, urmată de expunerea la o dietă bogată în grăsimi la vârsta adultă.
2. Materiale și metode
2.1. Animale
Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Campinas (UNICAMP) (număr de aprobare: 3379-1). Șoarecii C57Bl/6 masculi au fost obținuți de la UNICAMP și menținuți la 22 ± 1 ° C într-un ciclu de lumină întuneric de 12 ore. Șoarecii în vârstă de treizeci de zile au fost hrăniți cu o dietă normală de proteine (14% proteine) (grup NP) sau o dietă cu conținut scăzut de proteine (6% proteine) (grup LP) timp de 4 săptămâni. După aceea, șoarecii LP au fost distribuiți în trei grupe: LP, care a fost ținut cu o dietă săracă în proteine; LP + HF, care a început să primească o dietă bogată în grăsimi (35% grăsimi) în decurs de 8 săptămâni; și LP + HFvag, care a fost supus vagotomiei și, de asemenea, a început să primească o dietă bogată în grăsimi pe parcursul a 8 săptămâni. Compozițiile dietetice au fost descrise într-un studiu anterior [10].
2.2. Procedura de vagotomie subdiafragmatică
La 4 săptămâni după o dietă cu conținut scăzut de proteine, șoarecii LP + HF au fost supuși vagotomiei troncale subdiafragmatice (grup LP + HFvag) sau operației simulate (LP + HF). Pentru această procedură, șoarecii cu post de 12 ore au fost anesteziați cu un amestec de ketamină și xilazină (0,06 și 0,02 mg/g prin i.p., respectiv; Vetbrands®, Paulínia, SP, BRA). Ulterior, stomacul și esofagul au fost exteriorizate din cavitatea peritoneală și ambele, trunchiul vagal dorsal și subdiafragmatic, au fost separate de esofag și tăiate. Șoarecii operați de rușine au fost supuși acelorași proceduri, dar nervul vag a fost păstrat intact. La sfârșitul perioadei experimentale, pentru a confirma vagotomia subdiafragmatică, retenția alimentară stomacală de la toate grupurile de șoareci a fost evaluată prin raportul dintre greutatea stomacului pe greutatea corporală (BW), conform studiului anterior [11-13].
2.3. Test de toleranță intraperitoneală la glucoză și insulină
Pentru testul de toleranță la glucoză (ipGTT) intraperitoneal (ipGTT), șoarecii au fost postiti peste noapte (12 ore) și o probă de sânge bazală a fost recoltată din vârful cozii (t = 0 min). Șoarecii au primit o administrare ip de 2 g/kg glucoză (Labsynth, Sao Paulo, Brazilia) dizolvată în soluție salină (0,9% NaCl în greutate/vol) și s-au înregistrat probe de sânge suplimentare la 15, 30, 60 și 120 min. Glucoza a fost înregistrată folosind un glucometru portabil (Accu-Chek Performa II, Roche Diagnostics, Elveția). Pentru testul de toleranță la insulină ip (ipITT), șoarecii au fost posti timp de 2 ore și s-a administrat o sarcină de insulină ip (Humulin R, Eli Lilly, Indianapolis, SUA) (1 U/kg). Sângele a fost prelevat imediat înainte de injectarea insulinei (t = 0 min) și în momentele 3, 6, 9, 12, 15, 18 și 21 de minute prin snip coadă folosind un glucometru portabil. Rata de dispariție a glucozei (KITT) a fost calculat așa cum s-a descris anterior [14, 15].
2.4. Eliminarea insulinei
În timpul ipGTT, probele de sânge au fost colectate din vârful cozii, înainte de încărcarea glucozei (t = 0) și 15 și 60 de minute după administrarea glucozei și plasate în microtuburi care conțin heparină anticoagulantă. Tuburile au fost centrifugate la 1100
, 15 min, 4 ° C, iar plasma a fost colectată și depozitată la -80 ° C. Insulina și peptida C au fost măsurate prin Insulina de șobolan/șoarece sau peptida C 2 ELISA Kit (cat. EZRMI-13K și EZRMCP2-21K, EMD Millipore, SUA, resp.), Conform instrucțiunilor producătorului. Clearance-ul insulinei a fost evaluat prin raportul peptidă C: insulină, după cum s-a descris anterior [16].
2.5. Izolarea insulelor și GSIS
Insulele au fost izolate prin digestia colagenazei a pancreasului, așa cum este descris de Boschero și colab. 1995. Pentru incubații statice, grupuri de cinci insule au fost preincubate timp de 30 de minute la 37 ° C cu 500 μL de tampon Krebs (KBB) cu următoarea compoziție: 115 mM NaCI, 5 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 15 mM HEPES; suplimentat cu 5,6 mM glucoză și 3 g albumină serică bovină (BSA) pe litru; și echilibrat cu un amestec de 95% O2-5% CO2 pentru a obține pH 7,4. După aceea, acest mediu a fost înlocuit cu tampon proaspăt și insulele au fost incubate timp de 1 oră cu 1 mL de KBB conținând 5,6, 11,1 sau 16,7 mM glucoză. La sfârșitul perioadei de incubație, supernatantele au fost colectate și menținute la -20 ° C. Pentru conținutul de insulină din insulă, s-au colectat grupuri de cinci insule, s-au transferat în tuburi care conțin 1 ml apă deionizată și s-au omogenizat folosind un sonicator (Brinkmann Instruments, SUA). Insulina a fost măsurată prin RIA utilizând insulină umană marcată radioactiv cu 125 I ca trasor, insulină de șobolan ca standard (Crystal Chem Inc., SUA) și anticorp de insulină de șobolan (donat de Dr. Leclerq-Meyer, Universitatea Liberă din Bruxelles, Belgia). Metoda dextran cu cărbune a fost utilizată pentru a separa insulina liberă de insulina 125 I legată de anticorpi.
2.6. Western Blot
2.7. Analize statistice
Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM, iar diferențele au fost considerate semnificative atunci când
. Comparațiile au fost efectuate folosind un ANOVA unidirecțional, urmat de testul lui Tukey. Testele au fost efectuate folosind GraphPad Prism, versiunea 5.0 pentru Windows (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA). Mărimea eșantionului a fost determinată luând în considerare efectul mărimii. Statistica bilaterală cu un nivel de semnificație de 5% și potența de 0,98 a fost utilizată pentru a exclude erorile de tip II. În aceste condiții, dimensiunea recomandată a eșantionului necesară ar fi