Utilizarea Coxsackievirus B3 ca model de pancreapedie acută
Marcați/Căutați această postare
Jonathan H. Hall (1) și Dahn L. Clemens (1,2)
Tipul metodelor:
Versiune de intrare:
Citare:
| Utilizarea Coxsacklevirus B3 ca model de pancreatită acută.pdf | 497,11 KB |
1. Introducere
Pancreatita acută este o boală gastroenterologică gravă caracterizată prin inflamație și deteriorarea pancreasului exocrin. În general, se autolimită, dar în până la 20% din cazurile de complicații clinice severe se dezvoltă, rezultând pancreatită acută severă, cu o rată de mortalitate de până la 30% (25, 39, 40). Pancreatita acută severă este asociată cu inflamație sistemică, insuficiență multi-organ și mortalitate ridicată. Din păcate, în prezent nu există farmacoterapie specifică pentru a trata sau preveni progresia acestei boli.
Cei mai comuni factori etiologici asociați cu pancreatita acută la adulți sunt calculii biliari și abuzul de alcool, deși în 20-30% din cazuri cauza nu este cunoscută (6). În contrast, factorii etiologici comuni la copii includ medicamente, infecții, traume și anomalii anatomice (32). Interesant, într-o revizuire a literaturii Benifla și Weizman au raportat că aproximativ 10% din cazurile pediatrice de pancreatită acută au rezultat din infecții virale (3).
2. Materiale și reactivi
2.1 Materiale
- Agaroză
- Powdered Dulbecco’s Modified Eagle’s Media
- Ser fetal bovin
- Rotor și tuburi Bechman SW 28 sau SW 41
- Formaldehida
- Violet de cristal
- Omogenizatoare de sticlă (Râșnițe de țesut)
- 12 plăci de cultură de țesuturi
2.2 Reactivi
A. Preparare 0,5% Agaroză/DMEM
Soluția 0,5% agaroză/DMEM se realizează prin prepararea a 2 soluții separate: o soluție 1% de agaroză și o soluție de 2X DMEM. Soluția de agaroză 1% se prepară prin adăugarea a 1 gram de agaroză/100 ml apă distilată și sterilizată prin autoclavare. Soluția de agaroză este apoi răcită într-o baie de apă la 55 o C. Soluția 2X DMEM este preparată prin adăugarea de două ori a greutății recomandate de pulbere DMEM și bicarbonat de sodiu la volumul pe care doriți să îl preparați (în mod normal, 100 mL). PH-ul este ajustat la 7,2, este sterilizat prin filtru printr-un filtru de 0,22 μm și încălzit la 55 o C. Soluția 0,5% de agaroză/DMEM este preparată prin combinarea volumelor egale de soluții de agaroză și 2X DMEM imediat înainte de a o utiliza pentru suprapunere celulele.
b. Prepararea 20% formalină
Formalina este o soluție stoc de 37% formaldehidă. Pentru a prepara 20% formalină, soluția stoc de formalină se diluează 1: 5 folosind apă distilată rezultând 7,4% formaldehidă
c. Preparare 1% cristal violet
Violetul cristal este preparat prin adăugarea a 5 g de violet cristal la 395 ml H2O și 105 ml etanol 20%. Soluția este apoi filtrată printr-un filtru de 0,22 μm.
3. Metode
Virușii CVB3 sunt agenți patogeni umani (26, 34). Din acest motiv, atunci când lucrați cu CVB3, trebuie folosite măsuri de precauție BSL2. Toate lucrările cu aceste viruși trebuie efectuate într-un dulap de biosecuritate aprobat de tip II, iar orice echipament sau deșeuri solide potențial contaminate trebuie decontaminate cu o soluție de înălbitor de 10% sau prin autoclavare. După ce ați lucrat cu țesuturi sau soluții care pot fi contaminate cu CVB3, toate suprafețele trebuie curățate cu o soluție de înălbitor de 10%.
Tulpinile CVB3 pe care le folosim sunt agenți patogeni umani, care au fost izolați de indivizii care au suferit infecții CVB3. Acești viruși nu au fost adaptați la șoareci, dar provoacă o boală la șoareci similară cu cea observată la om (34). Din această cauză, cultivăm virusul în linii celulare de origine umană, în mod normal celule HeLa.
A. Creștere și izolare virală
b. Titrarea virală prin analiza plăcii
Folosim celule HeLa pentru a crește și a titra CVB3.