Tunelarea nanotubului (TNT) mediat de neuron-la neuron transferul de ansambluri proteice Tau patologice

Abstract

O celulă dată face schimburi cu vecinii săi printr-o varietate de mijloace, de la factori difuzibili la vezicule. Celulele folosesc, de asemenea, nanotuburi tunelate (TNT), structuri membranice care conțin actină filamentoasă, care pun în legătură și conectează celulele. Descrise mai întâi în celulele imune, TNT facilitează transferul HIV-1 și se găsesc în diferite tipuri de celule, inclusiv neuroni. Arătăm că proteina Tau, asociată microtubulilor, un jucător cheie în boala Alzheimer, este un component de bună-credință al TNT. Acest lucru este important deoarece Tau apare lângă actina filamentoasă și miozina 10 ca un marker specific al acestor proeminențe fine ale membranelor și citosolului care sunt dificil de vizualizat. Mai mult, am observat că speciile de Tau exogene cresc numărul de TNT stabilite între neuronii primari, facilitând astfel transferul intercelular al fibrilelor de Tau. În concluzie, Tau poate contribui la formarea și funcționarea TNT-urilor extrem de dinamice care pot fi implicate în propagarea asemănătoare prionică a ansamblurilor Tau.

Introducere

Înțelegerea transmiterii unui agent infecțios de la o celulă la alta a fost o provocare a secolului trecut. A fost demonstrată implicarea receptorilor de la suprafața celulei, dar au fost descrise și alte căi. Nanotuburile de tunelare (TNT) formează o astfel de cale. TNT-urile au fost descrise în diferite tipuri de celule, inclusiv celule neuronale și imune. Sunt structuri membranare care conțin actină filamentoasă, cu un diametru de la 50 la 800 nm, nu întotdeauna legate de substrat și formând punți care leagă celulele îndepărtate [1-6]. De exemplu, TNT-urile conectează fizic celulele T, prezentând o nouă cale pentru transmiterea HIV-1 [7]. În astfel de celule, tipul de TNT este o zonă activă de reorganizare a citoscheletului actinic și conține ezrin, Exo70, miozină 10 și N-WASP, sugerând o reglare la nivel celular [8, 9]. Factori extrinseci, cum ar fi acidul arahidonic în celulele endoteliale [10], infecția cu HIV-1 în macrofage [11], stresul oxidativ [12] și proteinele asemănătoare prionilor (de exemplu, fibrilele Huntingtin, TDP-43) în celulele neuronale [6, 13, 14] s-a demonstrat că declanșează formarea TNT.

Multe agregate de proteine au proprietăți asemănătoare prionilor: pot acționa ca șabloane de auto-propagare. Acestea perturbă proteostazia celulară, ducând în cele din urmă la tulburări neurodegenerative precum boala Alzheimer (AD), boala Parkinson (PD), scleroza laterală amiotrofică (SLA) sau encefalopatiile spongiforme transmisibile (EST) [15-17]. Mecanismele exacte ale răspândirii celule-la-celule a speciilor patologice sunt încă supuse unei investigații intense. Printre altele, rolul TNT în această propagare a fost sugerat în boala Huntington, boala Parkinson și SLA/demență fronto-temporală [18]. În ceea ce privește boala Alzheimer, s-a demonstrat că peptida amiloidă Aβ circulă prin TNT și induce citotoxicitate [12]. Rolul TNT-urilor în răspândirea Tau agregată nu a fost încă documentat.

În lucrarea de față, folosind două modele celulare diferite (celule neuronale CAD și neuroni corticali embrionari primari de șobolan), am demonstrat că speciile de Tau extracelulare acționează ca un factor extrinsec ducând la formarea crescută a TNT, care la rândul său facilitează răspândirea intercelulară a Tauului patologic.

Materiale și metode

Declarație de etică- Animalele erau furnizate de laboratoarele Janvier și aveau acces la hrană și apă ad libitum. Experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu și cu aprobarea comitetului local de etică (acord CEEA 062010R), a standardelor pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și a liniilor directoare ale Franței și Comunității Europene.

Cultură de celule

Cultura neuronală embrionară primară- Neuronii corticali embrionari primari ai șobolanilor (neuroni primari) au fost preparați din embrioni de șobolani Wistar în vârstă de 17-18 zile, după cum urmează. Creierul și meningele au fost îndepărtate. Cortexul a fost disecat și disociat mecanic în mediu de cultură prin triturare cu o pipetă Pasteur lustruită. Odată disociate și după numărarea trypanului albastru, celulele au fost placate în lăcuțe Ibidi μ-Bi (Biovalley) sau Lab-Tek cu lamele cu patru godeuri (Becton Dickinson) acoperite cu poli-D-lizină (0,5 mg/ml) și laminină (10 μg/ml). Pentru disociere, placare și întreținere, am utilizat mediu Neurobazal suplimentat cu 2% B27 și conținând 200 mM glutamină și 1% agent antibiotic-antimicotic (Invitrogen). Neuronii primari la 7 zile in vitro (DIV7) au fost infectați cu vectori lentivirali (VS) care codifică GFP/mCherry actină, tubulină sau Tau de tip sălbatic uman (hTau1N4R conținând o etichetă V5; V5-hTau1N4R).

Linii telefonice- Celulele CAD neuronale de șoarece (linia celulară neuronală catecolaminergică de șoarece, diferențiată cu Cath.a) au fost cultivate în Opti-MEM (Invitrogen) cu ser bovin fetal 10%, penicilină/streptomicină (1%) și L-glutamină (1%). Celulele neuronale CAD au fost placate peste noapte în poli-D-lizină (0,5 mg/mL) acoperite cu Ibidi μ-vase pentru imagistică în viu sau lamele Lab-Tek cu patru godeuri pentru imunocolorare. Celulele CAD neuronale au fost infectate cu LV-uri care codifică GFP-actină, mCherry-tubulină sau Tau de tip sălbatic uman (hTau1N4R conținând o etichetă V5; V5-hTau1N4R).