Tratamentul mediu condiționat sistemic din celulele stem mezenchimale amorsate interleukin-1 promovează
Abstract
fundal
Celulele stem mezenchimale (MSC) dețin un potențial mare ca terapie pentru accident vascular cerebral și s-a demonstrat anterior că promovează recuperarea în modele preclinice de ischemie cerebrală. MSC secretă o gamă largă de factori de creștere, chemokine, citokine și vezicule extracelulare - denumite în mod colectiv secretomul. În acest studiu, am evaluat pentru prima dată eficacitatea secretomului derivat din MSC-primat de IL-1α asupra leziunilor cerebrale și recuperării funcționale după ischemie cerebrală.
Metode
Accidentul vascular cerebral a fost indus la șoareci masculi C57BL/6 folosind modelul de filament intraluminal al ocluziei arterei cerebrale medii. Mediul condiționat din MSC-urile cu IL-1α sau vehiculul a fost administrat în momentul reperfuziei sau la 24 ore post-accident vascular cerebral prin injecție subcutanată.
Rezultate
Tratamentul mediu condiționat derivat din MSC, bazat pe IL-1α, în momentul accidentului vascular cerebral a dus la o
Reducerea cu 30% a volumului leziunii la 48 de ore și a fost asociată cu îmbunătățiri modeste ale creșterii masei corporale, scorului neurologic de 28 de puncte și construcției cuiburilor. Administrarea mediului condiționat derivat din MSC la 24 h post-accident vascular cerebral a condus la îmbunătățirea construcției cuibului și scor neurologic, în ciuda diferențelor observate în volumul leziunii în ziua 2 post-accident vascular cerebral.
Concluzii
Rezultatele noastre arată pentru prima dată că administrarea mediului condiționat din MSC-urile cu IL-1α conduce la îmbunătățiri ale rezultatelor comportamentale independent de neuroprotecție.
fundal
Accidentul vascular cerebral este o problemă de sănătate globală semnificativă care duce la aproximativ 6,7 milioane de decese anual [1]. Pentru cele 33 de milioane de persoane care trăiesc cu accident vascular cerebral, opțiunile de tratament sunt foarte limitate și nu ameliorează pe deplin dizabilitatea cauzată [2]. Prin urmare, există o cerere mare de terapii regenerative pentru a promova repararea și îmbunătățirea dizabilității după accident vascular cerebral ischemic.
O serie de strategii de precondiționare in vitro au fost explorate pentru a spori secretomul MSC, inclusiv cultura 3D [15] și precondiționarea hipoxică [16]. În lucrările noastre anterioare, am demonstrat în mod clar că amorsarea cu interleukina-1 alfa (IL-1α) conduce secretomul MSC către un fenotip mai antiinflamator și pro-trofic care se poate traduce într-o terapie mai bună pentru accidentul vascular cerebral ischemic [17]. În prezent, efectul unor astfel de strategii de precondiționare MSC nu a fost studiat pe larg în modele preclinice de accident vascular cerebral. Într-adevăr, din câte știm, există doar un astfel de studiu, care a evaluat eficacitatea CM derivată din MSC precondiționate hipoxie [13] asupra recuperării motorului și neuroprotecției într-un model de șobolan ischemic. Datele noastre in vitro publicate anterior demonstrează în mod clar că amorsarea IL-1α conduce MSC către un fenotip pro-reparator. Prin urmare, este esențial să se confirme beneficiul amorsării IL-1α într-o paradigmă in vivo relevantă, cu o caracterizare extinsă a repertoriului comportamental post-accident vascular cerebral, așa cum a fost investigat aici într-un model de șoarece de ocluzie a arterei cerebrale medii.
Metode
Caracterizarea MSC
Pentru caracterizare, MSC au fost colorate folosind kitul de analiză BD Stemflow ™ hMSC (BD Biosciences, Marea Britanie) conform instrucțiunilor producătorului. Celulele au fost apoi analizate pe un citometru cu flux invers (BD Biosciences, UK) pentru expresia pozitivă a markerilor de suprafață CD73, CD90 și CD105 și expresia negativă a CD11b, CD19, CD34, CD45 și HLA-DR, așa cum este definit de Societatea Internațională pentru Celulare Terapia ca criteriu minim pentru MSC [18] (Fișier suplimentar 1: Figura S1). Porțile pozitive au fost setate folosind fluorescența minus unu controale. Multipotența MSC a fost, de asemenea, evaluată utilizând un kit disponibil comercial (R&D Systems, UK). Pe scurt, MSC-urile au fost cultivate timp de 21 de zile în medii de diferențiere, cu schimbări de suport la fiecare 2-3 zile. Adipocitele au fost colorate cu Oil Red O (Millipore, UK), iar osteocitele au fost colorate cu Alizarin Red (Millipore, UK). Peletele de chondocite au fost tăiate în secțiuni de 30 μm folosind un microtom de săniuș înghețat (Bright Instruments, UK) apoi colorate cu albastru de toluidină (Sigma-Aldrich, UK). Imaginile au fost achiziționate folosind un microscop inversat (Olympus CK X31) și o cameră Moticam 2300 conectată la software-ul Motic Images Plus 2.0 ML (Motic, Hong Kong).
Cultură de celule stem mezenchimale
Pasajul 5-6 MSC derivate din măduva osoasă umană de la un donator fetal în vârstă de 22 de săptămâni (3H Biomedical, Suedia) au fost utilizate pentru toate experimentele. MSC au fost cultivate ca monostrat în baloane de cultură tisulară (Corning, Marea Britanie) în mediul MesenPRO RS (Invitrogen, Marea Britanie) suplimentat cu 1% penicilină/streptomicină și 2 mM glutamină. Mediul de creștere a fost schimbat la fiecare 4-5 zile până când celulele au fost 70-80% confluente. MSC-urile au fost apoi disociate cu 0,5% tripsină-EDTA (Sigma-Aldrich, Marea Britanie) și numărate. Pentru prepararea CM-α-primed CM (αCM), MSC au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri (Corning, Marea Britanie) la o densitate de 1,75 × 105 celule/godeu și incubate timp de 24 de ore. MSC-urile au fost apoi tratate cu 10 ng/ml IL-1α recombinant uman (R&D Systems, UK) timp de 5 minute. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS, apoi s-a adăugat mediu MesenPRO RS fără ser (fără supliment). După 24 de ore, s-a colectat αCM, resturile celulare au fost îndepărtate folosind filtre de seringă de 0,22-μM (Millipore, Marea Britanie) și 10 × concentrate folosind concentratoare centrifuge Vivaspin de 3000 MWCO (Generon, Marea Britanie) conform instrucțiunilor producătorului. Pentru vehicul, mediul MesenPRO RS fără ser a fost, de asemenea, concentrat de 10 ×. Pentru toate experimentele in vivo, tratamentele condiționate de 400 μl derivate din 3,5 × 105 celule au fost preparate în avans și depozitate la - 80 ° C.
Experimente in vivo
Animale
Toate procedurile pentru animale au fost efectuate în conformitate cu legea revizuită privind animalele (procedurile științifice) din 1986, sub licența de proiect a Home Office (Marea Britanie) și aprobate de Comitetul local de revizuire etică pentru bunăstarea animalelor. Animalele au fost adăpostite în grup în Sealsafe Plus Mouse cuști ventilate individual (Techniplast, Italia) la 21 ± 1 ° C, 55 ± 10% umiditate pe un ciclu de 12 ore lumină-întuneric. Toate cuștile au fost furnizate cu material de cuibărit Sizzle Nest (Datesand Ltd., UK) și tuburi de îmbogățire a cartonului (Datesand Ltd., UK). Șoarecii au avut acces ad libitum la dieta standard a rozătoarelor (SDS, UK) și la apă. Șoarecii au fost aclimatizați la instalație timp de cel puțin o săptămână înainte de începerea lucrărilor experimentale.