Tratamentul cu rosiglitazonă restabilește funcția receptorului de dopamină renală la hipertensiunea șobolanilor obezi Zucker

De la Heart and Kidney Institute, College of Pharmacy, Universitatea din Houston, Houston, Tex.

Vizualizați cea mai recentă versiune a acestui articol. Versiunile anterioare:

Abstract

În rinichi, receptorii dopaminei prezenți pe tubii proximali joacă un rol important în reglarea excreției de sodiu și apă în diferite condiții fiziologice. 1 Receptorii dopaminei există atât pe partea apicală, cât și pe cea bazolaterală a tubului proximal. 2 Dintre receptorii dopaminei prezenți pe tubii proximali, subtipul D1 a fost implicat în natriureza și diureza mediată de dopamină. 3 La nivelul mecanismului celular de acțiune, receptorii D1, prin cuplarea cu proteinele Gs și Gq, sunt legați de adenilil ciclaza și fosfolipaza C. 4-6 Activarea receptorilor D1 și stimularea ulterioară a căilor de mesagerie secundă duc inhibarea transportorilor de sodiu - schimbător Na/H (NHE) și Na, K-ATPAază (NKA) - și, prin urmare, o creștere a excreției renale de sodiu. 4.7-9

Numeroase rapoarte au arătat că răspunsul natriuretic la dopamina infuzată exogen sau produs endogen este tocit la șobolanii spontan hipertensivi (SHR), 10,11 din cauza receptorilor D1 defecți în tubii proximali. 12 Studiile in vitro sugerează că dopamina nu reușește să inhibe NKA și NHE în tubulii proximali ai SHR. 13,14 Un studiu recent efectuat pe celule epiteliale primare ale tubului proximal derivat din rinichi hipertensivi umani a relevat hiperfosforilarea receptorului D1 cauzată de GRK4 hiperactiv ca mecanism al receptorilor D1 defecți. 15 Defectul receptorului D1 este corectat odată ce GRK4 este reglat în jos prin tratarea cu GRK4-antisens specific. 15

În mod similar, am raportat recent că dopamina nu este capabilă să inhibe activitatea NKA și NHE în tubulii proximali ai șobolanilor obezi Zucker. 16.17 Cu toate acestea, spre deosebire de observațiile făcute în SHR, numărul receptorilor D1 atât pe membrana bazolaterală (BLM), cât și pe membrana de margine a periei (BBM) au fost reduse cu 50% la obezi în comparație cu șobolanii martori slabi. 16.17

Șobolanul Zucker obez este un model de hiperinsulinemie și diabet de tip 2. 18 Sa demonstrat că insulina afectează funcția celulară a diferiților hormoni prin modificarea numărului receptorilor sau a sensibilității receptorilor la liganzii acestora. 19-21 S-a raportat că răspunsul natriuretic la dopamina exogenă a fost redus la pacienții cu diabet zaharat de tip 2. 22 Pe baza acestor studii, am emis ipoteza că reducerea numărului de receptori D1 și incapacitatea dopaminei de a inhiba transportorii de sodiu la șobolanii obezi Zucker pot fi cauzate de hiperinsulinemie cronică, care, dacă este corectată, poate duce la restabilirea numărului receptorilor D1 și a funcției sale la șobolanii obezi. Prin urmare, în prezentul studiu, am tratat șobolani obezi Zucker cu rosiglitazonă, o tiazolidinedionă, care s-a dovedit că scade insulina plasmatică, prin îmbunătățirea sensibilității la insulină. 23.24 După tratamentul cu rosiglitazonă, numărul receptorilor D1 și efectul dopaminei asupra activității NKA au fost măsurate în tubulii proximali ai șobolanilor obezi. De asemenea, s-au efectuat experimente suplimentare în celulele epiteliale primare pentru a studia efectul insulinei asupra reglării receptorului D1 în condiții experimentale mai controlate.

Metode

Tratamentul animalelor și medicamentelor

Șobolani Zucker obezi masculi în vârstă de opt până la 9 săptămâni și șobolani Zucker masculi slabi (Harlan Sprague-Dawley Inc) au fost adăpostiți în cuști de plastic și au fost hrăniți cu chow de rozătoare normal și apă de la robinet ad libitum. Șobolanii obezi au fost separați în două grupuri: șobolani martor obezi și șobolani obezi tratați cu rosiglitazonă. Grupul de tratament a primit maleat de rosiglitazonă (10 mg/kg) suspendat în 1% carboxi metil celuloză în apă distilată pe cale orală timp de 4 săptămâni. Grupul martor obez a primit 1% carboxi metil celuloză. Șobolanii Lean Zucker nu au primit tratament. Fiecare grup era format din 6 șobolani.

Parametri generali și biochimici

Greutățile corporale au fost înregistrate la începutul și la sfârșitul tratamentului. La sfârșitul tratamentului, șobolanii au fost plasați în cuști metabolice timp de 24 de ore cu acces gratuit la apă. Probele de urină au fost colectate și analizate pentru sodiu și potasiu urinar folosind fotometrie cu flacără (Corning 480 Flame Photometer). Pentru măsurarea tensiunii arteriale, șobolanii au fost anesteziați cu pentobarbital de sodiu (50 mg/kg corp greutate IP). După o incizie pe linia mediană, aorta a fost cateterizată sub rinichi și tensiunea arterială a fost măsurată cu un traductor de presiune Statham și înregistrată pe un poligraf Grass timp de 30 de minute. Probele de sânge au fost colectate din aorta în tuburi acoperite cu EDTA pentru măsurarea glicemiei și a insulinei plasmatice. Glicemia a fost măsurată cu un analizor de glucoză (Roche Diagnostic Inc). Insulina plasmatică a fost măsurată prin radioimunotest, cu un kit comercial.

Izolarea și îmbogățirea tubulilor proximali

După măsurarea tensiunii arteriale și prelevarea probelor de sânge, șobolanii au fost folosiți pentru prepararea tubulilor renali proximali așa cum am descris mai devreme. 14 Proteinele au fost măsurate cu ajutorul unui kit (Pierce).

Na, testul K-ATPase

Suspensia tubulară proximală (1 mg proteină/ml) în tampon Krebs a fost incubată cu sau fără dopamină (1 nmol/L până la 1 μmol/L) la 37 ° C timp de 20 de minute. După incubare, tubulii au fost permeabilizați prin înghețarea rapidă în gheață uscată/acetonă și decongelare. Activitatea Na-K-ATPază sensibilă la Ouabain a fost măsurată 14 (exprimată ca nmol Pi/mg proteină pe minut).

Pregătirea membranei

Tubii proximali au fost omogenizați într-un tampon conținând (mmol/L) 10 Tris-HCI, 250 zaharoză, 0,2 fluorură de fenilmetilsulfonil, cocktail inhibitor de protează la pH 7,6 și centrifugat la 2500 g timp de 10 minute. Supernatantul a fost centrifugat la 24.000g timp de 20 de minute. Stratul pufos superior al peletei a fost resuspendat în același tampon, aruncat și centrifugat din nou la 24.000g timp de 20 de minute. Peleta a fost spălată cu tampon de spălare conținând 100 KCl, 100 manitol, 5 (-[2-hidroxietil] piperazină-′ - [[acid 2-etansulfonic]), pH 7,2 și centrifugat la 34.000g timp de 30 de minute. În cele din urmă, fracția de membrană (care conține atât BBM, cât și BLM) a fost resuspendată într-un volum mic de tampon de omogenizare și depozitată congelată pentru utilizare ulterioară.

[3 H] SCH 23390 Legare

Legarea [3 H] SCH 23390 de membranele tubulare proximale a fost efectuată în conformitate cu metoda descrisă anterior. 4.16 Pentru a genera izotermă de saturație, concentrația ligandului a fost variată de la 1 la 60 nmol/L. SCH 23390 rece (10 μmol/L) a fost utilizat pentru a determina legarea nespecifică. Datele specifice de legare au fost utilizate pentru a determina Bmax și Kvalori d.