Tehnici de purificare a proteinelor; Știri-Medical
Tehnicile de inginerie a proteinelor sunt o parte esențială a personalizării sau producerii proteinelor cu proprietăți specifice care pot fi aplicate în diferite procese industriale. Astfel, acestea sunt cruciale pentru cercetarea biotehnologică.
Cu toate acestea, aceste metode depind în mare măsură de capacitatea de a izola și purifica proteinele dorite, astfel încât proprietățile lor fizice și chimice să poată fi înțelese, împreună cu structurile lor terțiare și interacțiunile cu liganzi și substraturi.
Intensitatea la care se urmărește acest proces de purificare depinde de utilizarea la care trebuie pusă proteina. De exemplu, proteinele farmaceutice și alimentare trebuie să fie aduse la un grad ridicat de puritate și să treacă prin mai multe etape secvențiale, cât mai puține, deoarece la fiecare etapă se vor pierde inevitabil anumite proteine.
Purificarea moleculelor de proteine este mai simplă decât purificarea complexelor proteice.
Pasul 1: Crearea unui extract de proteine brute
Extractele brute de proteine intracelulare sunt preparate prin lizarea celulei utilizând procese chimice sau mecanice. Resturile sunt apoi îndepărtate prin centrifugare. Supernatantul rezultat este o formă departe de a fi pură, fiind amestecat cu multe alte macro și micromolecule.
Proteinele extracelulare se obțin prin centrifugarea soluției și îndepărtarea celulelor. O metodă specifică pentru obținerea unui extract brut de enzime termostabile este încălzirea amestecului astfel încât să se denatureze alte proteine și apoi să se răcească pentru a reforma proteinele termostabile de interes, centrifugându-l în final pentru a elimina proteinele denaturate.
Pasul 2: purificare intermediară
Sare
Proteinele dintr-un extract brut sunt apoi purificate prin precipitarea lor într-o soluție de sare foarte concentrată, cum ar fi sulfatul de amoniu. Acest lucru funcționează pe baza solubilității mai scăzute a proteinelor la concentrații mari de sare. Cu toate acestea, toate proteinele nu precipită la aceeași concentrație de sare, ceea ce înseamnă că sărarea ajută și la fracționarea proteinelor. Poate fi folosit și pentru concentrarea proteinelor în soluție. Această etapă crește puritatea de trei ori și 92% din proteina din soluție este recuperată.
Dializă
Proteinele sunt molecule mari și acest lucru înseamnă că sărurile proteice vor fi reținute prin trecerea soluției printr-o membrană semipermeabilă. Celuloza este o dializă membranară tipică. Dializa nu poate fi utilizată pentru a separa proteinele cu diferite greutăți moleculare.
Cromatografie
Alte tehnici utilizate pentru îndepărtarea proteinelor sărate includ cromatografia de excludere a gelului și filtrarea. Acestea sunt acum disponibile ca kituri preformate pentru multe proteine standard și sunt adesea potrivite pentru procese pe scară largă.
Filtrarea pe gel funcționează pe baza separării mărimii printr-o coloană de bile de polimer poros, cum ar fi dextran sau agaroză. Moleculele mari pot curge doar prin spațiile dintre margele, în timp ce cele mai mici ocupă ambele spații și spațiul din interiorul mărgelelor, încetinindu-le. Astfel, eluantul conține molecule care apar în ordinea mărimii lor, de la cea mai mare la cea mai mică. Se utilizează, de asemenea, tehnici de cromatografie cu fază inversă sau schimb de ioni, care funcționează pe baza proprietăților diferențiale hidrofobe și, respectiv, a sarcinii. Cromatografia în fază inversă poate fi limitată în aplicarea sa datorită unei posibile denaturări a proteinelor de către solvenți organici.