Supraexprimarea adipoasă a fosfoenolpiruvatului carboxicinază duce la o sensibilitate ridicată la

Abstract

BAT, țesut adipos maro
FFA, acid gras liber
PEPCK, fosfoenolpiruvat carboxicinaza
PGC, coactivator PPAR-γ
PPAR, proliferator de peroxizom - receptor activat
TZD, tiazolidindionă
UCP, proteine de decuplare
WAT, țesut adipos alb

Obezitatea este o problemă majoră de sănătate în societățile occidentale. Această modificare a funcțiilor metabolice și endocrine ale țesutului adipos este frecvent asociată cu rezistența la insulină și diabetul de tip 2. Nu este clar modul în care masa mărită a țesutului adipos duce la rezistența la insulină la nivelul ficatului și mușchilor și la hipersecreția insulinei pancreasului. Țesutul adipos secretă mai multe proteine numite adipocitokine care pot influența metabolismul glucozei și sensibilitatea la insulină și leagă creșterea adipozității și rezistenței la insulină (1,2). Cu toate acestea, excesul de acizi grași liberi (FFA) eliberați de țesutul adipos în obezitate poate fi, de asemenea, responsabil pentru dezvoltarea rezistenței la insulină (3-7). Creșterile nivelurilor de FFA plasmatice diminuează extracția insulinei de către ficat și sporesc gluconeogeneza hepatică (4,7). La nivelul mușchilor, rata crescută de oxidare a grăsimilor afectează eliminarea glucozei mediată de insulină, inhibând oxidarea glucozei și sinteza glicogenului (3). Mai mult, rezistența la insulină este asociată cu stimularea proliferării celulelor β și a secreției de insulină (6).

Acizii grași eliberați în sânge rezultă din diferența dintre hidroliza trigliceridelor din adipocite în timpul lipolizei și reutilizarea FFA de către celulele adipoase printr-un ciclu inutil de reesterificare denumită (8,9). Țesutul adipos tamponează fluxurile de lipide prin suprimarea eliberării de FFA și creșterea clearance-ului trigliceridelor (10). Cu toate acestea, în obezitate, afectarea acestei acțiuni de tamponare poate contribui la acumularea de trigliceride în ficatul, mușchiul scheletic și celulele β pancreatice, care la rândul lor pot duce la rezistență la insulină (10).

Tiazolidindionele (TZD), activatori specifici ai proliferatorului peroxizomului - receptor activat (PPAR) -γ, îmbunătățesc sensibilitatea la insulină la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 (11). TZD au un efect antidiabetic direct asupra metabolismului glucozei la nivelul mușchilor scheletici și al ficatului (12). În plus, TZD-urile cresc sensibilitatea la insulină prin creșterea capacității de stocare a lipidelor a țesutului adipos și reducerea nivelurilor circulante de FFA și trigliceride (13). TZD-urile scad eliberarea de acizi grași din țesutul adipos prin creșterea reesterificării FFA prin inducerea atât a fosfoenolpiruvatului carboxicinazei (PEPCK), o enzimă de reglare a gliceroneogenezei, cât și a glicerol kinazei.

Creșterea gliceroneogenezei la șoarecii transgenici care supraexprimă PEPCK în țesutul adipos duce la creșterea reesterificării FFA; dimensiunea mai mare a adipocitelor, masa grasă și greutatea corporală; și scăderea FFA circulante (16). Mai mult, în ciuda obezității, se păstrează toleranța la glucoză și sensibilitatea la insulină a întregului corp (16). Acest lucru sugerează că obezitatea fără FFA crescute în circulație nu duce la rezistență la insulină sau diabet de tip 2. Astfel, am examinat acești șoareci transgenici pentru a determina dacă reesterificarea FFA crescută contracarează rezistența la insulină indusă de o dietă bogată în grăsimi. După 6 săptămâni pe această dietă, șoarecii transgenici au câștigat mai multă greutate corporală și au prezentat o intoleranță mai pronunțată la glucoză și rezistență la insulină decât șoarecii de control. Astfel, în mod paradoxal, supraexpresia PEPCK determină sensibilitate la insulină pe o dietă normală, dar rezistența la insulină pe o dietă bogată în grăsimi.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Tratamentul șoarecilor.

Analiza ARN.

ARN-ul total a fost obținut din WAT și BAT utilizând reactiv de izolare Qiazol (Qiagen, Hilden, Germania). ARN-urile au fost separate prin electroforeză pe un gel de agaroză 1% conținând 2,2 mol/l formaldehidă. Bloturile nordice au fost hibridizate cu 32 de sonde PEPCK, PGC-1α, PPAR-γ, 18S rRNA și UCP-1 cADN (17-20).

Detectarea proteinelor prin Western blot.

Analiza Western blot a fost efectuată prin proceduri standard din omogenatele celulare totale de WAT și BAT (21). Țesuturile au fost omogenizate într-un tampon conținând 20 mmol/l HEPES pH 7,9, 25% (vol/vol) glicerol, 420 mmol/l NaCI, 10 mmol/l KCl, 0,5 mmol/l ditiotreitol, 1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l EDTA, 0,5 mmol/l fluorură de fenilmetilsulfonil, 20 μmol/l leupeptină, 20 μmol/l pepstatin, 20 μmol/l aprotinină, 50 mmol/l NaF și 2 mmol/l vanadat de Na. Probele au fost centrifugate (15.000 g) și o alicotă a supernatantului a fost testată pentru concentrația de proteine prin metoda Bradford, așa cum este descris de producător (testul proteinei Bio-Rad; Bio-Rad, Hercules, CA). Douăzeci și cinci de micrograme de proteină au fost analizate cu SDS-PAGE 10% și transferate în membranele de nitroceluloză. Proteinele au fost detectate folosind anticorp policlonal anti-PPAR-γ coactivator (PGC) -1 (Chemicon International, Temecula, CA) anticorp diluat 1: 2.000, anticorp policlonic anti-decuplare (UCP) -1 (Abcam, Cambridge, UK) diluat 1: 1.000 și iepure policlonal anti-piruvat carboxicinază (PCK) -1 (Abgent, San Diego, CA) diluat 1: 500.

Analize enzimatice, metabolite și hormonale.

Conținutul de trigliceride tisulare a fost determinat prin extragerea lipidelor totale din probe de ficat și BAT cu cloroform-metanol (2: 1 vol/vol) așa cum s-a descris anterior (22), separând fazele de cloroform și metanol-apă. Trigliceridele au fost apoi cuantificate spectrofotometric folosind un kit de testare enzimatică (GPO-PAP; Roche Diagnostics, Basel, Elveția). Glucoza a fost măsurată enzimatic (Glucoquant; Roche Diagnostics) în ser. Glucoza a fost, de asemenea, determinată în 5 μl de sânge utilizând un analizor Glucometer Elite (Bayer, Leverkusen, Germania). Trigliceridele serice au fost determinate enzimatic (GPO-PAP). FFA-urile au fost măsurate în ser prin metode acil-CoA sintază și acil-CoA oxidază (Wako Chemicals, Neuss, Germania). Nivelurile serice de insulină au fost măsurate prin radioimunotest (CIS Biointernational, Gif-Sur-Yvette, Franța). Concentrația de leptină a fost determinată în 5 μl de ser folosind un kit de testare imunoabsorbant legat de enzime (Crystal Chemical, Chicago, IL) urmând instrucțiunile producătorului. Nivelurile serice de adiponectină au fost măsurate prin radioimunotest (Linco, St. Charles, MO).

Teste de toleranță la glucoză și insulină.

Pentru testele de toleranță la glucoză, șoarecii de control trezit și transgenici au postit peste noapte (16 ore) cu acces gratuit la apă și li s-a administrat o injecție intraperitoneală de glucoză (1 g/kg corp greutate). Probele de sânge au fost obținute din vena cozii înainte de injecția de glucoză și la momentele indicate după încărcarea de glucoză, iar concentrația de glucoză a fost măsurată. Pentru testele de toleranță la insulină, insulina (0,75 UI/kg corp greutate; Humulin Regular; Eli Lilly, Indianapolis, IN) a fost injectată intraperitoneal la șoareci de control alimentați treaz și la șoareci transgenici. Concentrația de glucoză a fost determinată în probele de sânge obținute din vena cozii la momentele indicate după injectarea insulinei.