Sistem de pornire - oprire pentru semnalizarea PI3-kinazei - Akt prin S-nitrozilare a fosfatazei cu secvență
Editat de Solomon H. Snyder, Facultatea de Medicină a Universității Johns Hopkins, Baltimore, MD și aprobat la 17 mai 2011 (primit pentru revizuire 4 martie 2011)
Abstract
Oxidul nitric (NO) exercită răspunsuri celulare pleiotrope asupra proliferării, apoptozei, neurotransmisiei și neurotoxicității în mai multe tipuri de celule prin intermediul proteinei S-nitrozilare. Această modificare are loc prin intermediul reacției oxidative între NO și cisteină (Cys) tiol în prezența unui acceptor de electroni (cum ar fi O2 sau un metal de tranziție) sau prin transnitrozilare de la S-nitrozotiol la un alt Cys tiol (1-3) . Au fost publicate mai multe metode de detectare a proteinelor S-nitrozilate (SNO-Ps) prin utilizarea anticorpilor, fotolizei și afinității cu mercurul (4). În special, testul biotin-switch este un imunoblot modificat dezvoltat de Jaffrey și Snyder care a fost utilizat în mod obișnuit pentru a detecta SNO-Ps endogen; această metodă a avansat mult domeniul (5). Ulterior, au fost dezvoltate alte metode pentru a detecta SNO-Ps (6), dar unele dintre ele implică probe tratate cu concentrații mari de donator de NO. Cu toate acestea, în prezența concentrațiilor ridicate de NO, este posibil ca unele reziduuri de Cys să fie nitrosilate artificial S.
Matricile de anticorpi au fost utilizate pentru profilarea nivelurilor de expresie a proteinelor cu sensibilitate ridicată. Fiecare anticorp detectat poate fi validat pentru capacitatea sa de a lega proteinele în test. Probele care se hibridizează cu fiecare anticorp din matrice pot fi ușor detectate. Deși un număr de proteine au fost identificate ca substraturi pentru S-nitrozilare în ultimii ani (3-6), am emis ipoteza că mulți mai mulți candidați modificați de niveluri fiziologice de NO ar putea rămâne încă de identificat. Prin urmare, am testat dacă o matrice de anticorpi ar putea fi adaptată pentru identificarea SNO-Ps suplimentare și a funcțiilor lor fiziologice (patologice).
În studiul de față, am încercat să izolăm SNO-Ps în stare fiziologică printr-o matrice de anticorpi. Am pregătit extracte din celule tratate sau netratate cu NO și etichetate în mod specific cu biotină. Am descoperit că fosfataza cu omologie de secvență la tensină (PTEN) este preferențial S-nitrosilată prin concentrații scăzute de NO. Deși alte rapoarte au arătat că PTEN poate suferi nitrosilare S prin concentrații ridicate de NO (7-13), aici am găsit o semnificație a funcției (patologice) fiziologice a PTEN S-nitrosilat (SNO-PTEN) pe calea Akt folosind sisteme in vivo și in vitro. Rezultatele noastre sugerează că inhibarea activității PTEN prin S-nitrozilare mărește semnalizarea Akt, contribuind astfel la supraviețuirea celulei în creierele ischemice și la activarea NO sintetazei endoteliale (eNOS).
Rezultate
Screening pentru proteine neuronale S-nitrosilate.
Inițial, am dezvoltat un sistem unic de screening pentru izolarea SNO-Ps nedescrisă anterior în sistemele neuronale folosind o matrice de anticorpi. Probele au fost preparate din celule SH-SY5Y ale neuroblastomului uman care fuseseră expuse la ionoforul de calciu A23187, care activează NO sintază neuronală endogenă (nNOS) și eNOS pentru a produce concentrații fiziologice de NO. Reziduurile Cys nitrosilate S din lizatele celulare au fost convertite în forma lor biotinilată utilizând tehnica de comutare a biotinei (5). Aceste probe, conținând cisteine biotinilate, au fost supuse unei serii de anticorpi și s-au detectat intensități fluorescente (Fig. S1). Au fost identificați douăzeci și cinci de candidați, inclusiv SNO-Ps cunoscuți, cum ar fi caspaza, NOS și HDAC (Tabelul S1; ref. 14-16). Dintre ceilalți candidați, ne-am concentrat asupra efectului S-nitrozilării asupra activității PTEN și a funcțiilor sale fiziologice. PTEN este un regulator inhibitor al căii de semnalizare PI3-kinază/Akt, atenuând astfel creșterea, migrația și supraviețuirea celulei (17-21).
S-Nitrosilarea PTEN.
Pentru a valida S-nitrosilarea PTEN, am examinat dacă PTEN a fost semnificativ S-nitrosilat printr-o concentrație scăzută de donator fiziologic de NO S-nitrosocisteină (SNOC). SNOC a îmbunătățit semnificativ nivelul de SNO-PTEN în lizatele celulare și celulele intacte. SNO-PTEN nu a fost detectat în testele de control biotin-switch efectuate fără ascorbat pentru a elimina NO, prevenind astfel înlocuirea NO cu biotină (Fig. 1A). După cum era de așteptat, PTEN a fost extrem de sensibil la NO; Formarea SNO-PTEN a fost detectată în celulele 293 ale rinichiului embrionar uman (HEK) după tratamentul cu SNOC 1-10 μM (Fig. 1 B și C). Mai mult, această modificare a fost găsită și în celulele expuse la diferite alte tipuri de donatori de NO, inclusiv S-nitrozo-glutation (GSNO) și 2- (N, N-dietilamino) -diazenolat-2-oxid (DETA-NONOate; S2).
Apoi, pentru a investiga dacă NO generat endogen induce, de asemenea, formarea SNO-PTEN, am folosit celule HEK care exprimă stabil nNOS. PTEN a fost S-nitrosilat de NO endogen ca răspuns la A23187 într-o manieră sensibilă la inhibitorii NOS (Fig. 1D și Fig. S3). Mamifere PTEN are cinci cisteine în domeniul său fosfatază (17). Pentru a determina locul țintă al S-nitrozilării pe PTEN, am mutat fiecare cisteină în serină și am testat formarea SNO-PTEN utilizând metoda de schimbare a biotinei. Celulele HEK au fost transfectate cu vectori de expresie care codifică fie FLAG-PTEN de tip sălbatic (WT), fie forme mutante ale proteinei. După 24 de ore, celulele au fost expuse la SNOC sau condiții de control și au fost monitorizate pentru SNO-PTEN. Am constatat că mutantul C83S PTEN nu a produs aproape niciun semnal, sugerând că Cys-83 a fost locul predominant de S-nitrozilare (Fig. 1E). Mai mult, am efectuat un test chimic pe PTEN recombinant purificat pentru a detecta S-nitrozilarea folosind 2,3-diaminonaphtalene (DAN). DAN se convertește stoichiometric în 2,3-naftiltriazol fluorescent în prezența NO eliberat din S-nitrozotiol. PTEN tratat cu SNOC a dus la formarea semnificativă de SNO-P, în timp ce mutantul PTEN (C83S) a fost complet lipsit de semnal fluorescent (Fig. S3).