Sindaza de oxid nitric inductibil are efecte divergente asupra funcției vasculare și metabolice în obezitate

Abstract

În acest studiu, am folosit o abordare integrată in vivo și ex vivo într-un model murin de obezitate indusă de dietă pentru a explora mecanismele disfuncției endoteliale în obezitate, concentrându-ne pe posibila implicare a iNOS. Raportăm o serie de descoperiri noi: 1) obezitatea se caracterizează prin expresia iNOS în vasculatură; 2) producția vasculară de ROS compensează vasodilatația mediată de acetilcolină; 3) șoarecii lipsiți de iNOS sunt protejați împotriva rezistenței legate de obezitate la efectele de scădere a glucozei și vasodilatatoare ale insulinei, dar au totuși tensiune arterială crescută și relaxare afectată la acetilcolină, care este compensată de producția de ROS.

nitric

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Șoarecii masculi de tip sălbatic (WT) C57BL/6J au fost crescuți în laboratoarele noastre. Șoarecii homozigoti iNOS KO pe fundal C57BL/6J au fost un cadou amabil de la Dr. A.J. Hobbs (University College London). Obezitatea a fost indusă prin hrănirea șoarecilor cu o dietă bogată în grăsimi (5.286 kcal/kg; Bioserve) de la înțărcare. Animalele de control au fost hrănite cu o dietă standard. Șoarecii au fost adăpostiți într-o instalație convențională pentru animale cu un ciclu de lumină: întuneric de 12: 12 ore. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu Regatul Unit. Legea privind procedurile științifice (1986) privind funcționarea animalelor.

Evaluarea reglării metabolice, a lipidelor plasmatice și a nitriților din plasmă.

După 4 și 8 săptămâni de hrănire, testele de toleranță la glucoză și insulină au fost efectuate la șoareci conștienți prin prelevarea repetată a sângelui după o injecție intraperitoneală de glucoză (1 mg/g) sau insulină umană (0,75 unitate/kg), așa cum s-a descris anterior (22) . Glicemia a fost măsurată folosind un dispozitiv portabil (Hemocue, Sheffield, Marea Britanie), iar nivelurile de insulină au fost evaluate printr-un radioimunotest hipersensibil specific (Linco Research, St. Charles, MO). Scorul de sensibilitate la insulină a evaluării modelului homeostatic (HOMA) a fost calculat ca insulină × glucoză ÷ 22,5. Probele de sânge au fost obținute din vena safenă laterală, iar nivelurile de glucoză au fost măsurate în sângele integral. Acizii grași liberi și trigliceridele au fost măsurate în plasmă de post folosind teste colorimetrice (Roche, Mannheim, Germania; ThermoTrace, Victoria, Australia). Nitritul plasmatic a fost măsurat utilizând reacția Griess (14).

Măsurarea in vivo a tensiunii arteriale.

Tensiunea arterială sistolică a fost măsurată utilizând pletismografie cu coș (22,23) la șoareci conștienți preîncălziți timp de 10 min într-un dispozitiv de control termostatic (XBP1000; Kent Scientific). Trei sesiuni de antrenament au fost efectuate în timpul săptămânii înainte de efectuarea măsurătorilor. Media de cel puțin șase înregistrări separate de trei ori a fost luată pentru a calcula tensiunea arterială sistolică medie.

Evaluarea ex vivo a funcției vasculare.

Răspunsul vascular mediat de NO la insulină a fost evaluat prin construirea de curbe de doză-răspuns de fenilefrină înainte și după o expunere de 2 ore la insulină (100 mU/ml). Am demonstrat anterior la șoareci sănătoși că insulina determină tocirea dependentă de endoteliu a răspunsului vasoconstrictor la fenilefrină și că acest efect este abolit de l-NMMA; adică nu este mediat de NO (23).

Măsurarea in situ a producției vasculare a speciilor reactive de oxigen.

Generarea ROS în aorta in situ a fost măsurată utilizând fluorescența dihidroethidium (DHE), după cum sa raportat anterior (24,26). Pentru a explora posibilitatea ca producția de ROS vascular să fie stimulată de acetilcolină, fluorescența DHE a fost evaluată în inele aortice care fuseseră expuse la acetilcolină sau soluție salină. Intensitatea fluorescenței la suprafața endotelială a fost cuantificată microscopic din cel puțin cinci câmpuri aleatorii (1.024-1.022 pixeli; 269,7 × 269,2 μm) per diapozitiv și trei diapozitive pe condiție experimentală, utilizând un sistem computerizat de analiză a imaginii (Improvizare).

Exprimarea ARNm NOS în aortă.

ARN-ul total a fost extras din aortă (Mini Fibrous Kit; Quiagen) și cantități egale au fost transcrise invers folosind Superscript II RT (Invitrogen) și oligonucleotide decamer aleatorii. Analizele RT-PCR în timp real pentru expresia ARNm eNOS, nNOS, iNOS și β-actină au fost efectuate în duplicat folosind sistemul de detectare a secvenței ABI Prism 7000 (23). Au fost utilizate grunduri și sonde marcate cu FAM specifice acestor gene (teste la cerere; Biosisteme aplicate). ADNc a fost amplificat în următoarele condiții: 10 min la 95 ° C, urmat de 40 de cicluri de 15 s la 95 ° C și 1 min la 60 ° C. Metoda curbei standard (Buletinul utilizatorului nr. 2; Sisteme ABI) a fost utilizată pentru cuantificare, iar rezultatele au fost normalizate pentru exprimarea β-actinei.