Shp2 controlează greutatea corpului feminin și echilibrul energetic prin integrarea semnalelor de leptină și estrogen

ABSTRACT

INTRODUCERE

La mamifere, leptina reglează aportul de alimente și echilibrul energetic, în principal prin activarea receptorului de leptină sub formă lungă (LepRb) și căile de semnalizare în aval în hipotalamus, iar deficitul de leptină provoacă obezitate și diabet, precum și funcții de reproducere afectate (14, 15, 31) . S-a arătat că SH2-tirozin fosfataza Shp2 se leagă direct de LepRb activat prin andocarea pe p-Tyr985 în domeniul intracelular (23, 37). Ablația genetică a Shp2 în sistemul nervos central a dus la obezitate brută asociată cu rezistența la leptină și scăderea p-Erk, sugerând un rol pozitiv al Shp2 în amplificarea semnalului de leptină în hipotalamus (2, 22, 37).

Estradiolul-17β (E2), un hormon reproductiv, joacă, de asemenea, un rol vital în metabolismul energetic și controlul greutății corporale (13). Ștergerea aromatazei care catalizează formarea estrogenului sau perturbarea receptorului de estrogen α (ERα) duce la obezitate mai severă dependentă de vârstă la femei decât la bărbați, indicând faptul că deficitul de estrogen este responsabil pentru progresia obezității dimorfice sexual (19, 21 ). La femeile aflate în postmenopauză sau la rozătoarele ovariectomizate, deficiența de estrogen este asociată cu o probabilitate crescută de obezitate și diabet de tip 2 (7, 32). Înlocuirea estrogenului la animalele ovariectomizate suprimă dezvoltarea obeză prin scăderea aportului de alimente și creșterea cheltuielilor de energie (17). Tratamentul hormonal la femeile aflate în postmenopauză previne progresia obezității și îmbunătățește sensibilitatea la insulină și toleranța la glucoză (33). În schimb, ștergerea sau reducerea la tăcere a ERα în hipotalamus duce la obezitate și defecte metabolice la rozătoare (19, 25). Estrogenul are un efect asemănător leptinei în activarea semnalelor intracelulare în celulele melanocortinei hipotalamice (16). Cu toate acestea, rămâne de stabilit modul în care semnalizarea estrogenului este legată de calea leptinei.

Rolul pozitiv al Shp2 în medierea semnalului de leptină în creier a prezis că îmbunătățirea farmaceutică a activității Shp2 la nivel local în creier ar depăși rezistența la leptină și va atenua obezitatea. Pentru a testa această ipoteză, am generat o linie de șoarece transgenic cu expresie în neuronii din creier anterior a unui mutant activ activ (câștig de funcție) Shp2 D61A, care s-a dovedit că prezintă o activitate fosfatazică crescută dramatic, fără a afecta activitatea sa de legare a SH2 (26) . Caracterizarea șoarecilor transgenici a relevat un rol neașteptat critic al Shp2 în cuplarea semnalizării leptinei și estrogenului. Aceste date completează un gol în cunoștințele noastre despre funcția de suprapunere a acestor doi hormoni în metabolism și ajută la demonstrarea de ce femeile aflate în postmenopauză tind să dezvolte obezitate.

MATERIALE ȘI METODE

Generarea șoarecilor transgenici Shp2 D61A. Mutantul Shp2 D61A a fost creat prin mutageneză direcționată de site folosind ADNc-ul Shp2 de șoarece ca șablon. Fragmentul Shp2 D61A mutant cu o secvență de tag hemaglutinină (HA) la capătul C a fost subclonat în vectorul pcDNA3.1. Promotorul citomegalovirusului (CMV) din plasmida pcDNA3.1 a fost înlocuit cu promotorul CaMKIIα (12) pentru a conduce expresia mutantului Shp2 D61A -HA. Construcția proiectată a fost injectată în ovocitele fertilizate de șoareci C57BL/6 pentru a genera o linie de șoarece transgenic în instalația pentru animale de la Sanford/Burnham Medical Research Institute (SBMRI). Toate procedurile pentru animale au fost aprobate de Universitatea din California, San Diego și de comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor SBMRI.

Injecție AAV. Sistemul de expresie a virusului adeno-asociat (AAV) (Stratagene) a fost utilizat pentru a produce proteina fluorescentă verde AAV (GFP) și virusul AAV-Shp2 D61A -GFP. Virușii AAV au fost injectați în hipotalamusul mediobasal al șoarecilor așa cum s-a descris anterior (38). Pe scurt, injecția bilaterală în hipotalamusul mediobazal a fost direcționată utilizând o stereotaxă ultraprecisă cu o rezoluție de 10 μm (Kopf Instruments) la coordonatele de 1,5 mm posterioare bregmei, 5,8 mm sub bregma și 0,3 mm laterale față de linia mediană. Virușii suspendați în lichidul cefalorahidian au fost injectați timp de 10 minute printr-o canulă de ghidare cu calibru 26 și un injector cu calibru 33 (Plastics One) conectat la o seringă Hamilton și la o pompă de perfuzie (WPI Instruments).

Hrănirea HFD și ovariectomia. Șoarecii de tip sălbatic (wt) și transgenici la vârsta de 8 până la 10 săptămâni au fost hrăniți fie cu o dietă bogată în grăsimi cu 58% kcal (HFD; catalog nr. D12331; Research Diets), fie cu o dietă cu 6% kcal chow (catalog nr. 8664; Harlan Teklad) timp de 20 de săptămâni (24). Greutatea corporală a șoarecilor a fost monitorizată săptămânal. Pentru a măsura aportul de alimente, șoarecii au fost separați în cuști individuale, iar modificările cantităților de alimente au fost înregistrate zilnic. Ovariectomia a fost efectuată la șoareci femele în greutate și transgenici la vârsta de 10 până la 12 săptămâni. La 1 săptămână după operație, șoarecii au fost hrăniți fie cu HFD, fie cu o dietă regulată, timp de 8 săptămâni, iar greutățile corpului lor au fost monitorizate bisăptămânal.

Analize metabolice. Nivelurile serice de insulină și leptină au fost măsurate folosind truse comerciale (nr. Catalog 90030 și nr. Catalog INSKR020; Crystal Chem). Estradiolul (Cayman), testosteronul (Cayman) și corticosteronul (Enzo Life Science) au fost măsurate prin imunoanaliză enzimatică. Un test de toleranță la insulină (ITT) și un test de toleranță la glucoză (GTT) au fost efectuate pe șoareci Shp2 D61A și wt la vârsta de 24 până la 26 de săptămâni, după hrănirea cu HFD timp de 16 până la 18 săptămâni. Pentru ITT, insulina (Humulin R; Eli Lilly) a fost injectată intraperitoneal (1 U/kg [greutate corporală]), iar nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate cu un glucometru (Lifescan One-Touch Basic) la 0, 15, 30, 60 și 120 min. Pentru GTT, animalele au fost postite timp de 12 până la 16 ore și injectate cu glucoză (1,5 g/kg [greutate corporală]), iar apoi nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate la 0, 15, 30, 60 și 120 de minute.

Pentru sensibilitatea la leptină, șoarecii hrăniți cu HFD sau dieta chow timp de 16 săptămâni au fost injectați intraperitoneal cu leptină (1,5 μg/kg [greutate corporală]; Programul Național de Hormoni și Peptide) de două ori pe zi timp de 3 zile (7:30 și 18:30) doză, 1,5 μg/kg [greutate corporală]) (24). Șoarecii au fost separați în cuști individuale și plasați pe dieta chow. Greutatea corporală și aportul de alimente au fost monitorizate zilnic timp de 7 zile. Consumul de O2 și producția de CO2 au fost măsurate utilizând sistemul Oxymax (Columbus Instruments).

Studii de semnalizare celulară. Șoarecii la vârsta de 30 de săptămâni hrăniți cu HFD timp de 20 de săptămâni au fost la post timp de 12 până la 16 ore. Leptina (1,5 μg/kg [greutate corporală]), estradiol-17β (nr. Catalog 3301 [Calbiochem], 50 μM/kg [greutate corporală]) și soluție salină au fost administrate intraperitoneal cu 1 oră înainte de sacrificiu. Creierul a fost izolat cu atenție și omogenizat cu tampon de liză tisulară, iar apoi lizatul a fost centrifugat la 14.000 rpm timp de 30 de minute de două ori. Lizatele care conțin 50 μg de proteine au fost imunoblotate pentru pY-Stat3 (catalog nr. 9131; Cell Signaling), Stat3 (catalog nr. 9132; Cell Signaling), pAkt-s473 (catalog nr. 9271; Cell Signaling), pAkt-t308 catalog 9275; Semnalizare celulară), Akt (nr. catalog 9272; Semnalizare celulară), pY-Src și Src (Semnalizare celulară), pErk1/2 (nr. catalog 9101; Semnalizare celulară), adiponectină (Millipore) și HA ( Actualizați). Creierul șoarecelui a fost izolat după perfuzie cu 4% paraformaldehidă (PFA) pentru secționarea înghețată. Antimorpii Shp2 (syp de casă sau sc-280; Santa Cruz Biotechnology), anticorpul ERα (sc-542; Santa Cruz Biotechnology) și anticorpul pY-Stat3 au fost folosiți pentru imunocolorare. Ficatul a fost colectat pentru secționarea înghețată și apoi colorat cu roșu O-ulei sau cu hematoxilină și eozină (H&E) (4). Țesutul adipos a fost fixat prin soluție Z-Fix timp de 24 de ore pentru a efectua colorarea H&E. Probele de creier au fost colectate pentru secționarea înghețată și colorate de anticorpi.