Scăderea lactotransferinei hepatice induce steatoza hepatică în ficatul gras non-alcoolic cronic
Profesorul BuHyun Youn
Departamentul de Științe Biologice,
Universitatea Națională Pusan Busandaehak-ro 63 beon-gil,
Geumjeong-gu, Busan, 46241 (Coreea)
Tel. 82-51-510-2264, Fax 82-51-581-2962, E-mail [email protected]
Articole similare pentru „”
- Stare de nervozitate
Abstract
Introducere
Lactotransferrina (Ltf) este o glicoproteină care leagă fierul secretată în lapte și în fluidele interstițiale și are diferite funcții, inclusiv antiinflamatoare, -biotice, -oxidante, -virale și -cancer [13]. Mai mult, administrarea Ltf s-a arătat anterior că reduce acumularea de lipide hepatice și ameliorează NAFLD la modelele murine [13, 14]. Majoritatea investigațiilor cu privire la rolul Ltf în prevenirea NAFLD au fost efectuate acum un deceniu și s-a descoperit că Ltf a prevenit NAFLD prin suprimarea captării chilomicronului [15]. Mai mult, un studiu structural a explicat că Ltf conține o regiune bogată în arginină, care era similară cu locul apolipoproteinei E (ApoE) care se leagă de receptorul lipoproteinelor cu densitate scăzută (LDLr), proteinei legate de LDLr 1 (LRP-1) sau lipolizei -receptorul de lipoproteine stimulat (LSR) [16]. În studiul recent, s-a confirmat că Ltf se leagă de LSR și inhibă clearance-ul chilomicronului prin experimente de blotare a ligandului [17]. Cu toate acestea, rolul expresiei hepatice Ltf în reglarea NAFLD și mecanismul de reglare a expresiei Ltf încă nu au fost încă elucidate.
Stabilirea unui model animal adecvat este importantă pentru investigațiile preclinice. În studiile de investigare a mecanismului dezvoltării NAFLD, mulți in vivo Modelele NAFLD au fost generate de diete, inclusiv dietă bogată în fructoză, bogată în grăsimi și MCD (deficiență de metionină și colină) sau prin modificări genetice, inclusiv supraexprimarea SREBP-1c sau reducerea silențioasă a PPARα [18]. Abordări pentru stabilirea unui nou model NAFLD au fost sugerate în mod constant în studii pentru a elucida mecanismul molecular al NAFLD. Cu toate acestea, modelele au arătat în mod obișnuit acumularea severă de lipide hepatice în câteva zile, care este prea scurtă pentru a imita steatoza hepatică inițială a pacienților, chiar luând în considerare diferența de timp a șoarecilor umani și șoareci [19]. Pe măsură ce dezvoltarea NAFLD a petrecut câteva luni la pacienți, modelul de dezvoltare cronică a NAFLD poate arăta sub evenimente moleculare hepatice în modelele acute. În plus, utilizarea modelelor NAFLD induse de dietă nu a putut identifica forța motrice a NAFLD găsită la pacienții fără dietă anormală sau mutații genetice. Prin urmare, modelul NAFLD cronic și independent de dietă poate depăși limitarea modelelor actuale de șoarece NAFLD.
În acest studiu, am efectuat o investigație pentru a descoperi mecanismul steatozei hepatice inițiale prin stabilirea unui nou model de șoarece NAFLD cu iradiere a întregului corp pe baza studiilor anterioare. Am analizat apoi profilurile transcriptomice hepatice și am demonstrat mecanismul molecular al steatozei hepatice.
Materiale și metode
Linii celulare, cultivare și transfecție
AML12 (linia celulară de hepatocite normale murine), MIHA și HL-7702 (linia celulară de hepatocite normale umane) au fost utilizate în cercetare. Linia de celule AML12 a fost daruită cu generozitate de prof. Univ. Heung-Sik Choi (Universitatea Națională Chonnam, Gwangju, Republica Coreea). Linia celulară MIHA a fost daruită cu generozitate de prof. Univ. Suk Woo Nam (Universitatea Catolică din Coreea, Seul, Republica Coreea). Linia de celule HL-7702 a fost daruită cu generozitate de prof. Univ. Soon-Sun Hong (Școala de Medicină a Universității Inha, Incheon, Republica Coreea). AML12 a fost crescut în DMEM/F-12, MIHA a fost crescut în DMEM și HL-7702 a fost crescut în RPMI-1640 conținând 10% FBS, 100U/ml penicilină și 100 ug/ml streptomicină. Celulele au fost incubate în atmosferă umidificată, 95% aer/5% CO2 la 37 ° C.
Transfecția tranzitorie a fost efectuată în urma studiului anterior [25]. Pe scurt, amestecul de Lipofectamine ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) și pCMV6-Ltf (Origene Technologies, Rockville, MD) a fost incubat 30 de minute pentru formarea lipozomilor și aplicat pe celulele MIHA sau HL-7702 timp de 12 ore. După schimbul cu medii proaspete, celulele au fost utilizate pentru alte experimente.
Anticorpi și reactivi
Anticorpii primari specifici pentru Ltf, p-Stat5, Stat5, α-tubulin au fost cumpărați de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anticorpii secundari specifici pentru IgG de șoarece, IgG de iepure și IgG de capră au fost achiziționați de la Enzo Life Sciences (Ann Arbor, MI). Hormonul de creștere (GH) a fost achiziționat de la Prospec (East Brunswick, NJ), iar coumestrolul a fost achiziționat de la Enzo Life Sciences.
Protocolul și iradierea animalelor
Experimentele pe animale au fost efectuate în urma studiului anterior [26, 27]. Pe scurt, șoarecii masculi C57BL/6 de 3 săptămâni au fost cumpărați de la Orient Bio Inc. (Busan, Republica Coreea). Protocoalele pentru animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Națională Pusan (Busan, Republica Coreea) și efectuate în conformitate cu prevederile Ghidului NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Șoarecii au fost adăpostiți individual sau în grupuri de până la cinci în cuști sterile. Animalele au fost întreținute în unități de îngrijire a animalelor într-o cameră cu temperatură reglată (23 ± 1 ° C) sub un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore, alocate și randomizate pentru experimentele de către tehnicianul instalației și puse în carantină timp de 1 săptămână înainte de studiu. Animalele au fost hrănite cu apă și cu o dietă standard pentru șoareci ad libitum. Pentru experimentele pe animale pentru modelul de șoarece NAFLD indus de dietă, șoarecii au fost hrăniți cu dietă bogată în fructoză (60% fructoză în greutate), bogată în grăsimi (60% calorii din grăsimi) sau dietă MCD.
Șoarecii au fost anesteziați înainte de iradiere și expuși la iradiere unică de 6 Gy de raze gamma generate de extractorul Gamma Cell 40 (Nordion International Inc., Kanata, Ontario, Canada). Șoarecii iradiați au fost incubați timp de 5 săptămâni și injectați intraperitoneal cu GH (2 ug/g · zi) sau coumestrol (0,5 ug/g · zi) conform experimentelor. Șoarecii au fost sacrificați după anestezie, iar sângele și ficatul au fost recoltate pentru analiză în urma studiului anterior [28]. Sângele a fost colectat din inimă, coagulat, iar serul a fost izolat prin centrifugare (1500 g, 15 min). Serul a fost înghețat la -70 ° C până la alte experimente. Ficatul a fost tăiat în grosimea de 4 mm și înmuiat într-un compus de temperatură optimă de tăiere (OCT) (Sakura Finetek, Tokyo, Japonia) pentru analize histologice. Probele de ficat din stânga au fost înghețate direct în azot lichid, depozitate la -70 ° C până la alte experimente.