Răspunsul genomic al rinichiului șoarecelui la dieta cu conținut scăzut de fosfat este modificat în X-linked

Laborator de cercetare ortopedică, Centrul Medical Carolinas, Charlotte, Carolina de Nord 28232-2861

Abstract

Mecanismul de adaptare renală la diete cu conținut scăzut de fosfat nu este bine înțeles. Fie că Hyp mutație a Phex genele blochează această adaptare, de asemenea, nu este clar. Pentru a obține mai multe informații despre acest lucru, normal de 5 săptămâni și Hyp șoarecii au fost hrăniți cu o dietă martor (1,0% P) sau cu o dietă săracă în fosfați (0,03% P) timp de 3-5 zile. ARN-ul renal a fost hibridizat cu microarrays Affymetrix U74Av2 (5 matrici/grup). Din cele 5.719 gene detectabile de pe fiecare matrice, 290 au răspuns semnificativ ( rinichiul mamiferului are o rată variabilă de reabsorbție tubulară renală a fosfatului care răspunde la modificările nivelurilor de fosfat dietetic (33). Consumul redus de fosfat alimentar stimulează reabsorbția (maxim tubular, Tm) a fosfatului și crește sinteza renală a 1,25-dihidroxivitaminei D3 (16, 26). Deși se știu multe despre proteinele care transportă ionii fosfat peste membrana celulară (27), se știe mai puțin despre hormoni și citokine care reglează acest proces. O altă zonă de incertitudine este procesul prin care fosfatul reabsorbit traversează interiorul celulei.

Două protocoale experimentale sunt disponibile pentru a studia acest sistem. Dietele cu conținut scăzut de fosfați vor stimula mecanismele homeostatice pentru conservarea fosfatului (16, 26). În plus, mutațiile pierderii funcției ale Phex gena va bloca această adaptare și va suprima conservarea fosfatului (26). Se știe că mutațiile acestei gene apar la pacienții umani cu hipofosfatemie legată de X (33) și la Hyp și Gy mutații șoarecilor (8, 13, 37).

În acest proiect, expresia genei mARN în rinichiul șoarecelui a fost studiată prin tehnologia ADN microarray. Am emis ipoteza că genele care participă la răspunsul renal la modificarea aportului alimentar de fosfat ar răspunde la stimularea printr-o dietă cu conținut scăzut de fosfat și/sau inhibarea de către Hyp mutaţie. 1

1 Societatea Americană de Fiziologie a sponsorizat o întâlnire la hotelul Riverfront Augusta din Augusta, Georgia, 1-4 octombrie 2003, intitulată „Înțelegerea funcției renale și cardiovasculare prin intermediul genomicii fiziologice” și organizată de David Pollock de la Colegiul Medical din Georgia raport de întâlnire de către Moreno C și Pollock DM. Genomică fiziolică 16: 178–179, 2004; 10.1152/fiziolgenomică.00195.2003. http://physiolgenomics.physiology.org/cgi/content/full/16/2/178).

Acest protocol a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Centrul Medical Carolinas. Hipofosfatemic normal și legat de X, Hyp, șoareci au fost crescuți în colonia noastră pe fundalul C57BL/6J din stoc provenind din Laboratorul Jackson, Bar Harbor, ME, așa cum s-a descris anterior (18). Crescătorii au fost hrăniți cu Teklad Mouse Breeder Diet (W) nr. 8626 (Harlan, Madison, WI) și apă de la robinet ad libitum. Puii au fost înțărcați la vârsta de 3 săptămâni și au trecut la Teklad Rodent Diet (W) nr. 8604 (Harlan). La vârsta de 5 săptămâni, șoareci, Hyp [mascul hemizigot (Hyp/ Y) și femelă heterozigotăHyp/ +)] și șoarecii masculi și femele normali (tip sălbatic) au fost hrăniți cu control (1,0% P, Teklad 86129) sau cu o dietă cu conținut scăzut de fosfat (0,03% P, Teklad 86128) timp de 3-5 zile.

Animalele au fost apoi anesteziate, un tub capilar (70 μl) de sânge a fost colectat din sinusul orbital și ambii rinichi au fost recoltați. Rinichii au fost congelați în azot lichid și depozitați la -75 ° C. Rinichii au fost apoi cântăriți și omogenizați, iar ARN-ul total a fost extras cu TRIzol (GIBCO-BRL; Invitrogen, Gaithersburg, MD) (15). Fosfatul anorganic plasmatic a fost măsurat prin metoda lui Chen și colab. (5).

Proiectare experimentală.

Cantități egale de ARN de la trei șoareci, potrivite pentru genotip, sex, dietă și timpul din dietă au fost reunite pentru a crea fiecare probă pentru analiza microarray. Au fost făcute patru grupuri de tratament: 1) Șoarecii normali au alimentat dieta de control, 2) șoareci normali hrăniți cu o dietă săracă în fosfați, 3) Hyp șoarecii care au alimentat dieta de control sau 4) Hyp șoarecii au alimentat o dietă săracă în fosfați. S-au făcut cinci replici cu fiecare replică conținând o probă din fiecare dintre cele patru grupuri de tratament pentru un total de 20 de probe independente (60 șoareci în total). Fiecare replică a fost potrivită pentru tovarăși de sex, sex (3 replici de șoareci masculi și 2 de șoareci femele), timp pe dietă (3 replici la 5 zile și 2 la 3 zile) și procesare paralel.

Analiza microarray.

Eșantioanele au fost prelucrate așa cum este descris în Manualul tehnic pentru analiza expresiei Affymetrix GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA; Rev. 1, partea nr. 701021, http://www.affymetrix.com). Pregătirea eșantionului este descrisă aici pe scurt. Probele cu ARN de 30 μg au fost purificate pe coloane RNeasy de la Qiagen (Valencia, CA; produs nr. 74104) și apoi convertite în ADNc dublu catenar cu un kit de sinteză ADNc catenă dublă SuperScript (produs nr. 11917-010; Invitrogen, Carlsbad, CA). ADNc a fost apoi exprimat ca ARNc marcat cu biotină prin transcriere in vitro (IVT) cu trusa de etichetare a transcrierii ARN Enzo (Affymetrix, produs nr. 900182). Fiecare probă a fost adăugată cu bioB, bioC, bioD și cre (Affymetrix, produs nr. 900299). ARNc marcat cu biotină a fost fragmentat nonenzimatic. ARNc fragmentat din cele 20 de probe independente a fost hibridizat cu 20 de microarrays U74Av2 de șoarece (Affymetrix, produs nr. 900343) în tampon de hibridizare Affymetrix timp de 16 ore la 45 ° C. Tablourile hibridizate au fost spălate și colorate în Affymetrix Fluidics Station 400 pentru a atașa etichete fluorescente la biotină, urmate de anticorp marcat cu biotină și apoi a doua colorare cu marcare fluorescentă a biotinei. Fiecare matrice a fost scanată de două ori de către scanerul Agilent GeneArray G2500A (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).