PTP-3 (LAR PTPR) promovează plierea intramoleculară a SYD-2 (liprină-a) pentru a inactiva UNC-104 (KIF1A) în

Găsiți acest autor pe Google Scholar
Găsiți acest autor pe PubMed
Căutați acest autor pe acest site
Record ORCID pentru Oliver Ingvar Wagner
Pentru corespondență: [email protected]

Abstract

Introducere

Rezultate

Interacțiuni funcționale și genetice între UNC-104, SYD-2 și PTP-3

(A-E) PTP-3B: CFP și GFP: SYD-2 colocalizare în inele nervoase (A-D) și corzi nervoase ventrale (E). (D) Imagine PDM pseudo-colorată (vezi Materiale și metode) indicând o colocalizare cuantificabilă între SYD-2 și PTP-3B în inelul nervos. (F) Cuantificarea ICQ a datelor prezentate în (C). (G) Semnal pozitiv PTP-3B/SYD-2 BiFC în inelul nervos al viermilor vii, indicând faptul că SYD-2 și PTP-3B sunt cel puțin 7-10 nm apropiați unul de celălalt. (H) Vierme care exprimă SNB-1: mRFP sub un promotor pan-neuronal. (I) Imagine combinată din (G) și (H). (J) Stive de VNC îndreptate (corzi nervoase ventrale) și neuroni ALM cu semnale PFC-3B/SYD-2 BiFC pozitive. * - indică localizarea somas în neuronii ALM. Barele la scară: 10 µm. N = 10 viermi în (F). Bara de eroare: ± max. și min. gamă. A - direcția anterioară și P - direcția posterioară.

Lipsa PTP-3B declanșează stări desfășurate crescute ale SYD-2

Deoarece SYD-2 există în stări pliate funcționale, propunem că plierea intramoleculară a SYD-2 afectează tendințele sale de legare la UNC-104. După cum s-a menționat mai sus, presupunem că la mutanții ptp-3 defosforilarea diminuată a SYD-2 la Y741 ar duce la creșterea stărilor desfășurate care ar spori interacțiunile sale cu UNC-104. Pentru a aborda această întrebare, am folosit teste FRET intramoleculare [39] așa cum este descris în Figura 3A. Din Figura 3B și C este evident că raportul FRET (IFRET/ID) al fuziunii Cypet: SYD-2: Ypet este redus semnificativ în mutanții ptp-3 (mu256), indicând faptul că stările desfăcute ale SYD-2 sunt mai pronunțată în absența PTP-3. În mod critic, dărâmarea genei ptp-3 folosind ARNi a condus la observații comparabile (Fig. 3C; Supliment. Fig. 3). Ca control, am proiectat un mutant SYD-2 non-fosforilabil Y741F și raporturile sale FRET sunt comparabile cu cele ale Cypet: SYD-2: Ypet exprimate la animale de tip sălbatic N2. Mai mult, o construcție SYD-2 Y741E cu fosfomimizare a condus la rapoarte FRET comparabile cu cele ale constructului Cypet: SYD-2: Ypet nemodificat exprimat în mutanți ptp-3 (mu256) (Fig. 3B + C). Aceste descoperiri demonstrează că SYD-2 apare într-o conformație deschisă mai pronunțată în absența PTP-3 și că acest mecanism este probabil o funcție a activității fosfatazei PTP-3 pe tirozină 741 din SYD-2.

(A) acumulări UNC-104 și modele de distribuție în segmente îndreptate de neuroni sub-laterali preluați de la viermi diferiți dintr-o populație și stivuite unul pe altul. (B) Dimensiunile clusterului UNC-104 în neuronii sub-laterali. (C) densitățile UNC-104 de-a lungul neuronilor sub-laterali. Bara de scalare: 10 µm. Graficul cutiei cu bare mediane și de eroare: ± max. și min. gamă. ANOVA unidirecțional cu test de comparație multiplu LSD Fisher. **** p 750 de evenimente. Parcele de cutii cu bare mediane și de eroare: ± max. și min. gamă. ANOVA unidirecțional cu testul de comparație multiplu LSD Fisher pentru UNC-104 în tulpini mutante și testul t cu corecția lui Welch pentru RNAi și SNB-1. **** p "rel =" gallery-fragment-images-1283311614 "data-figure-caption ="

Rezumat pictural al rezultatelor acestui studiu. PTP-3 este în amonte de SYD-2 care reglementează activitatea UNC-104. PTP-3 defosforilează SYD-2 în poziția Y741 rezultând plierea intramoleculară a SYD-2 care inactivează concomitent UNC-104. Viceversa, lipsa PTP-3 are ca rezultat configurații mai deschise ale SYD-2, rezultând o interacțiune sporită cu UNC-104 [3] promovând schele UNC-104 crescute de-a lungul axonului și activând UNC-104 cu viteze vizibil crescute. Cu toate acestea, STV-urile se acumulează în soma datorită expresiei reduse a syd-2 și unc-104 la mutanții ptp-3.

Materiale și metode

Constructe plasmidice și tulpini C. elegans

Tulpina mutantă ZM607 syd-2 (ok217) poartă o ștergere a majorității domeniilor CC N-terminale din gena syd-2 ducând la o mutație nulă [2]. Această ștergere a fost confirmată prin PCR utilizând următorul exemplu de set: CGCGGGAATTATGCCTATTA (înainte) și TTGCATCTGCAAAAGAAACG (invers). Tulpina mutantă RB633 ptp-3 (ok244) poartă o ștergere a trei domenii FN3 ducând la o schimbare de cadru și la terminarea prematură a izoformei PTP-3A. Ștergerea a fost confirmată prin PCR utilizând următorul set de exemple: ACCCAAACGTTACCGAACAG (înainte) și CCAGGGACTGCAGGAAAATA (invers). Tulpina mutantă CZ3761 ptp-3 (mu256) se caracterizează printr-o inserție a unui singur nucleotid în exonul 25 al genei ptp-3 rezultând o schimbare de cadru care duce la o oprire prematură la AA1777 (Sup. Fig. 1) [23]. Această inserție de nucleotidă unică a fost confirmată prin secvențiere și, în plus, s-a găsit o mutație de la G la T (rezultând codificarea aceleiași mutații de aminoacid - leucină), patru nucleotide în amonte de inserția menționată mai sus. Cu toate acestea, inserția unui singur nucleotid ar trebui să conducă la o oprire prematură care să ducă la o mutație nulă, așa cum este descris în [23]. Rețineți că viermii mutanți ptp-3 (mu256) au dezvăluit fenotipuri ușoare de retenție a ouălor (Sup. Fig. 2).