Proteina de cod dietetică restabilește activarea indusă de insulină a fosfatidilinozitolului 3-kinazei Akt și

Abstract

Dezvoltarea rezistenței la insulină periferică este o caracteristică importantă a diabetului de tip 2 (1,2). Mușchiul scheletic, reprezentând> 75% din eliminarea glucozei în starea postprandială (1) reprezintă o țintă terapeutică atractivă pentru prevenirea acestei boli. Mecanismul prin care insulina mărește absorbția glucozei în mușchi implică translocarea transportorului glucozei sensibil la insulină GLUT4 dintr-un loc de stocare intracelular către membrana plasmatică și tubulii T (3-5). S-a dovedit că translocația GLUT4 este defectă la nivelul mușchilor scheletici la subiecții diabetici insulino-rezistenți și de tip 2 (6-8). Insulina stimulează translocația GLUT4 prin activarea receptorului activității sale tirozin kinazei intrinseci către substraturi intracelulare (5). În mușchiul scheletic, acest lucru duce la fosforilarea tirozinei substratului receptorului de insulină (IRS) -1 și IRS-2 conducând la recrutarea și activarea 3-kinazei fosfatidilinozitol (PI), o enzimă cheie în reglarea transportului glucozei stimulat de insulină (9).

proteina

Identificarea efectorilor din aval de PI 3-kinază implicați în reglarea transportului glucozei face obiectul unei investigații intense. Acestea includ serina/treonina kinaze Akt (denumită și protein kinază B [PKB]) și protein kinază C atipică (aPKC). Dovezi ale implicației atât a Akt cât și aPKC în reglarea insulino-dependentă a transportului glucozei în celulele musculare provine din studii de transfecție folosind fie kinază inactivă, fie supraexprimare/forme constitutiv active ale kinazelor (10-13). În timp ce un defect în activarea insulinei PI-kinazei este bine stabilit la mușchiul animalelor rezistente la insulină (14-17), rolul potențial al oricărui Akt al aPKC în patogeneza rezistenței la insulină rămâne slab definit. Folosind șobolanul bogat în grăsimi ca model de rezistență la insulină legată de obezitate, am descoperit recent că acțiunea insulinei atât asupra activităților kinazice Akt, cât și aPKC sunt tocite în mușchiul scheletic al acestor șobolani (14). Aceste afectări ale semnalizării insulinei au fost asociate cu o abrogare completă a translocației GLUT4 stimulate de insulină atât la membrana plasmatică, cât și la domeniile tubulilor T de pe suprafața celulei musculare (14).

Se depun mult efort pentru a găsi noi abordări terapeutice pentru a depăși rezistența la insulină la om. S-a dovedit că intervențiile dietetice sunt o tactică utilă și eficientă pentru sensibilizarea țesuturilor țintă la insulină la animale (18). De exemplu, sa demonstrat că acizii grași polinesaturați ω-3 derivați din pești îmbunătățesc sensibilitatea la insulină la șobolanii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (19). Mai recent, am investigat efectele proteinelor dietetice asupra sensibilității la insulină în obezitatea indusă de dietă. Am constatat că proteinele de cod din dietă, dar nu cazeina sau proteina din soia, au împiedicat dezvoltarea rezistenței la insulină a întregului corp prin normalizarea absorbției de glucoză stimulată de insulină în mușchii șobolanilor cu conținut ridicat de grăsimi. Acest lucru a fost observat în ciuda creșterii în greutate corporală, a adipozității și a expresiei TNF-α similare atât în ​​țesutul adipos, cât și în mușchiul scheletic din diferitele grupuri dietetice (20).

Prin urmare, acest studiu a fost întreprins pentru a clarifica mecanismele celulare din spatele acțiunii sensibilizatoare la insulină a proteinei de cod la șobolanii obezi cu conținut ridicat de grăsimi. Mai specific, am testat ipotezele conform cărora proteina de cod previne rezistența la insulină a mușchilor scheletici prin 1) îmbunătățirea semnalizării insulinei către PI 3-kinază, Akt și aPKC, 2) creșterea expresiei proteinei GLUT4 și/sau 3) îmbunătățirea translocației GLUT4 către suprafața celulelor musculare.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Materiale.

Tratamentul animalelor.

Clemă hiperinsulinemică-euglicemică și injecție trasoare.

Stimularea acută a insulinei.

Șobolanii care au postit peste noapte au fost injectați fie cu soluție salină, fie cu insulină (8 unități/kg) timp de 4 minute, așa cum s-a descris anterior (4). Mușchii au fost excizați rapid și înghețați imediat în azot lichid. Mușchii Gastrocnemius au fost omogenizați în șase volume de tampon de liză (20 mmol/l Tris, pH 7,5, 140 mmol/l NaCI, 1 mmol/l CaCl2, 1 mmol/l MgCl2, 10% glicerol, 10 mmol/l pirofosfat de sodiu, 10 mmol/l NaF, 2 mmol/l Na3VO4, 2 mg/ml benzamidină și 1 mmol/l PMSF) și inhibitori de protează cocktail. S-a adăugat acid okadaic (100 nmol/l) în tampon de liză pentru activitățile kinazice Akt și aPKC. Omogenatele musculare au fost solubilizate în 1% NP-40 timp de 1 oră la 4 ° C și centrifugate la 14.000 g timp de 10 min. Supernatantul a fost utilizat pentru studii de semnalizare a insulinei așa cum este descris mai jos.

Fosforilarea tirozinei a receptorului de insulină și a IRS.

Lizatele musculare (1 mg de proteină) au fost imunoprecipitate cu 2 μg de anti-fosfotirozină (4G10) cuplată cu proteina A-Sepharose peste noapte la 4 ° C. Complexul imun a fost spălat de trei ori în PBS (pH 7,4) conținând 1% NP-40 și 2 mmol/l Na3VO4, resuspendat în tampon Laemmli și fiert timp de 5 minute. Proteinele au fost rezolvate pe SDS-PAGE (gel 6%) și procesate pentru analiza Western blot.

Activitatea PI 3-kinazei.

Lizatul muscular (1 mg de proteină) a fost imunoprecipitat cu 2 μg de anti-IRS-1 cuplat cu proteina A-Sefaroză peste noapte la 4 ° C. Complexul imunitar a fost spălat de două ori cu Wash I (PBS, pH 7,4, 1% NP-40 și 2 mmol/l Na3VO4), de două ori cu Wash II (100 mmol/l Tris, pH 7,5, 500 mmol/l LiCl și 2 mmol/l Na3VO4) și de două ori cu Wash III (10 mmol/l Tris, pH 7,5, 100 mmol/l NaCI, 1 mmol/l EDTA și 2 mmol/l Na3VO4). Margelele au fost resuspendate în 70 μl de tampon kinazic (8 mmol/l Tris, pH 7,5, 80 mmol/l NaCI, 0,8 mmol/l EDTA, 15 mmol/l MgCl2, 180 μmol/l ATP și 5 μCi [γ- 32 P] ATP) și 10 μl amestec sonic PI (20 μg l -α-PI, 10 mmol/l Tris, pH 7,5 și 1 mmol/l EGTA) timp de 15 minute la 30 ° C. Reacția a fost oprită prin adăugarea de 20 pl 8 moli/l HCI, amestecată cu 160 pl CHCI3: CH3OH (1: 1) și centrifugată. Faza organică inferioară a fost reperată pe placă TLC cu silicagel tratată cu oxalat și dezvoltată în CHCI3: CH3OH: H2O: NH4OH (60: 47: 11,6: 2). Placa a fost uscată și vizualizată prin autoradiografie cu ecran de intensificare la -80 ° C.

Act/PKB activitate.

Lizatul muscular (1 mg de proteină) a fost imunoprecipitat cu 4 μg de anti-Akt 1/2 cuplat la proteina G-Sepharose timp de 4 ore la 4 ° C. Complexul imun a fost spălat de două ori cu Wash I (PBS, pH 7,4, 1% NP-40 și 100 μmol/l Na3VO4) și de două ori cu Wash II (50 mmol/l tris, pH 7,5, 10 mmol/l MgCl2 și 1 mmol/l TDT). Margelele au fost resuspendate în 30 μl de tampon kinază (50 mmol/l Tris, pH 7,5, 10 mmol/l MgCl2, 1 mmol/l DTT, 8 μmol/l ATP, 2 μCi [γ- 32 P] ATP și 50 μmol/l Crosstide) timp de 30 de minute la 30 ° C. Produsul de reacție a fost rezolvat pe un gel de acrilamidă 40% și vizualizat prin autoradiografie cu ecran de intensificare la -80 ° C.

Activitate PKC atipică (ζ/λ).

Lizatul muscular (1 mg de proteină) a fost imunoprecipitat cu 2 μg de anti-PKC (ζ/λ) peste noapte la 4 ° C, apoi complexul imun a fost colectat pe proteina A/G-Sepharose timp de 2 ore. Margelele au fost spălate de două ori cu Wash I (PBS, pH 7,4, 1% NP-40 și 2 mmol/l Na3VO4), de două ori cu Wash II (100 mmol/l Tris, pH 7,5, 500 mmol/l LiCl și 100 μmol/l Na3VO4) și de două ori cu Wash III (50 mmol/l Tris, pH 7,5, 10 mmol/l MgCl2 și 100 μmol/l Na3VO4). Margelele au fost resuspendate în 30 μl de tampon kinazic (50 mmol/l Tris, pH 7,5, 10 mmol/l MgCl2, 40 μmol/l ATP, 5 μCi [γ- 32 P] ATP și 5 μg proteină bazică mielină) pentru 12 min la 30 ° C. Reacția a fost oprită prin adăugarea de tampon Laemmli și încălzită timp de 30 de minute la 37 ° C. Produsul de reacție a fost rezolvat pe 13% SDS-PAGE. Gelul a fost uscat și vizualizat prin autoradiografie cu ecran de intensificare la -80 ° C.