Protecție potențială împotriva diabetului de tip 2 în obezitate prin expresia CD36 inferioară și îmbunătățită

Abstract

Introducere

Hiperglicemia cauzată de acțiunea insuficientă a insulinei caracterizează diabetul de tip 2 (T2D). Rezistența la insulină și secreția de insulină defectă sunt cei doi factori patogeni majori ai bolii și ambii sunt puternic asociați cu stilul de viață și componentele genetice (1,2). Obezitatea este unul dintre factorii de risc puternici pentru dezvoltarea T2D. În obezitate, acumularea de lipide este frecventă nu numai în țesutul adipos, ci și în țesuturile ectopice, cum ar fi ficatul și mușchiul scheletic. Acumularea de lipide intracelulare în țesuturile ectopice duce la deteriorarea semnalizării insulinei și promovează rezistența sistemică la insulină (3). Cu toate acestea, nu toți indivizii obezi dezvoltă T2D deoarece celulele β pancreatice se pot ajusta, într-o anumită măsură, pentru o cerere crescută de insulină. Disfuncția pancreatică a celulelor β este centrală în eșecul ajustării pentru rezistența crescută la insulină. Într-adevăr, răspunsul redus la insulină în prima fază poate fi observat, cel puțin la unii indivizi, deja înainte de dezvoltarea T2D (4). Aceste descoperiri sugerează că cei care nu se pot adapta la cererea suplimentară prin creșterea secreției de insulină sunt predispuși la T2D.

La fel ca țesuturile țintă ale insulinei, celulele β producătoare de insulină s-au dovedit a fi deteriorate de acumularea excesivă de lipide, un concept cunoscut sub numele de lipotoxicitate a celulelor β (5). În această afecțiune, lipidele acumulate, în special triacilglicerolul, provoacă stres celular, disfuncții și moartea celulei β. De fapt, s-a observat o acumulare crescută de picături lipidice cu IMC crescut în celulele β umane (6). O serie de studii in vitro au identificat mecanisme implicate în afectarea secreției de insulină prin creșterea acidului gras cronic (FA) (7,8), inclusiv cele care afectează exocitoza (9). Mai mult, semnalizarea insulinei în celulele β este esențială nu numai pentru creștere, ci și pentru reglarea corectă a funcției celulare (10-12). Prin urmare, împreună aceste descoperiri indică faptul că rezistența la insulină și secreția de insulină defectă sunt susceptibile de a împărtăși etiologii comune în ceea ce privește acumularea de lipide. Atât sinteza endogenă a FA, cât și absorbția FA sunt considerate ca fiind importante pentru creșterea acumulării de lipide în celulele β (13,14).

Arătăm în acest studiu că, printre donatorii umani cu obezitate, capacitatea de secreție de insulină a insulelor pancreatice și exocitoza celulelor β au fost semnificativ mai mici la donatorii cu T2D decât în non-T2D (ND). Am comparat nivelurile de expresie ale transportorilor FA în insulele lor pentru a aborda rolul facilitării absorbției FA pentru secreția de insulină defectă. Am explorat în detaliu calea de semnalizare implicată în secreția de insulină modulată CD36 în celulele β utilizând celule INS-1 care poartă un sistem Tet-on pentru supraexprimarea CD36. În cele din urmă, am testat potențialul terapeutic al unui anticorp neutralizant CD36 pentru a îmbunătăți funcția celulelor β în celulele EndoC-βH1 umane.

Proiectare și metode de cercetare

Linia celulară și cultura

Celulele INS-1 care transportă sistemul Tet-on pentru supraexpresia CD36 (15) au fost cultivate cu mediu RPMI 1640 conținând 11,1 mmol/L glucoză, 10% FBS, 100 UI/mL penicilină, 100 μg/mL streptomicină, 50 mg/mL neomicină, 50 mg/mL higromicină, 10 mmol/L HEPES, 1 mmol/L piruvat de sodiu și 50 μmol/L β-mercaptoetanol la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Pentru a induce expresia CD36, celulele au fost însămânțate în plăci cu 24 sau 48 de godeuri și cultivate cu sau fără doxiciclină de 500 ng/ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) timp de 72 de ore.

Celulele EndoC-βH1 (16) au fost cultivate în vase acoperite cu Matrigel/fibronectină (respectiv 100 μg/ml și respectiv 2 μg/ml) (Sigma-Aldrich) cu DMEM conținând 5,6 mmol/L glucoză, 2% BSA, 10 mmol/L nicotinamidă, 50 μmol/L β-mercaptoetanol, 5,5 μg/mL transferrin, 6,7 ng/mL selenit de sodiu, 100 UI/mL penicilină și 100 μg/mL streptomicină la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Celulele au fost însămânțate în plăci cu 48 de godeuri acoperite cu Matrigel/fibronectină și cultivate timp de 72 ore cu 2 μg/ml de anticorp blocant CD36 (FA6.125, număr de catalog 60084; STEMCELL Technologies, Vancouver, British Columbia, Canada) sau un controlul izotipului (MOPC-21, număr de catalog ab18443; Abcam, Cambridge, Marea Britanie).

Insulele pancreatice umane

Insulele pancreatice umane au fost obținute de la donatori de cadavre de origine europeană de către Rețeaua nordică pentru transplantul de insule clinice. Insulele au fost procesate așa cum s-a descris anterior (17) și selectate manual sub stereomicroscop înainte de utilizare. Pentru a se disocia în celule unice, insulele au fost incubate cu 3 mmol/L EGTA în soluție de sare echilibrată a Hanks conținând 0,25% BSA timp de 15 minute la 37 ° C urmată de pipetare ușoară. Caracteristicile donatorului pentru fiecare experiment sunt prezentate în tabelul suplimentar 1. Toate procedurile care utilizează insulele umane au fost aprobate de comitetele etice din Uppsala și Malmö/Lund, Suedia.

Analiza datelor de secvențiere a ARN-ului insulei umane

Datele de secvențiere a ARN-ului insulinei (ARN-seq) au fost extrase din Genn Expression Omnibus cu numerele de acces GSE50398 și GSE108072 din studiile lui Fadista și colab. (18) și Gandasi și colab. (19), respectiv. Valorile expresiei sunt exprimate ca numărare log2 la milion după normalizare și transformare folosind voom. Nivelurile de expresie ale genelor selectate au fost preluate de la 68 de donatori cu greutate corporală normală (IMC 2) și 31 de donatori obezi (IMC ≥30 kg/m 2).

Analiza secreției de insulină

Pentru celulele CD36 INS-1, după ce au fost spălate de două ori cu 1 ml tampon de testare a secreției preîncălzite (SAB) (1,16 mmol/L MgSO4, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L KH2PO4, 114 mmol/L NaCl, 2,5 mmol/L CaCl2, 25,5 mmol/L NaHCO3, 20 mmol/L HEPES și 0,2% BSA, pH 7,2) cu 2,8 mmol/L glucoză, celulele au fost preincubate în 0,5 ml SAB cu 2,8 mmol/L glucoză timp de 1 oră. Celulele au fost apoi stimulate timp de 1 oră în 0,25 ml SAB cu 2,8 mmol/L glucoză sau 16,7 mmol/L glucoză sau timp de 15 minute în 0,25 ml SAB cu 2,8 mmol/L glucoză și 50 mmol/L KCl la 37 ° C. Nivelurile secretate de insulină au fost măsurate folosind ELISA de insulină de șobolan (Mercodia, Uppsala, Suedia), iar valorile au fost normalizate la conținutul de proteine. Proteina a fost extrasă cu 100 μL tampon RIPA (0,1% SDS, 150 nmol/L NaCl, 1% Triton X-100 și 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8,0), iar conținutul a fost analizat folosind un kit de testare a proteinei BCA (Thermo Fisher Scientific).

Pentru celulele EndoC-βH1, mediul de cultură a fost schimbat într-un mediu care conține 2,8 mmol/L glucoză și incubat în continuare timp de 18 ore înainte de testarea secreției. După două spălări cu 1 ml SAB conținând 1 mmol/L glucoză, celulele au fost preincubate în 0,5 ml SAB cu 1 mmol/L glucoză timp de 2 ore. Celulele au fost apoi stimulate timp de 15 minute cu 0,25 ml SAB cu 1 mmol/L glucoză sau 20 mmol/L glucoză la 37 ° C. Nivelurile de insulină secretate au fost măsurate utilizând insulina umană ELISA (Mercodia), iar valorile au fost normalizate la conținutul de proteine. Conținutul de proteine a fost măsurat ca mai sus.

Pentru insulele umane, secreția de insulină stimulată de glucoză a fost examinată utilizând un sistem dinamic de perifuzie a glucozei pentru a calcula indicele de stimulare ca control al calității (20). Pentru a evalua secreția de insulină indusă de depolarizarea membranei, loturi de 12 insule au fost preincubate timp de 30 de minute în tampon bicarbonat Krebs-Ringer, pH 7,4, suplimentat cu 20 mmol/L HEPES, 0,1% BSA și 1 mmol/L glucoză și apoi stimulate pentru 1 h în tampon bicarbonat Krebs-Ringer cu 70 mmol/L KCl și 1 mmol/L glucoză.