Prostaglandina D-Sintaza de tip lipocalină ca lipocalină enzimatică - Baza de date Madame Curie Bioscience

Bibliotecă NCBI. Un serviciu al Bibliotecii Naționale de Medicină, Institutele Naționale de Sănătate.

Baza de date Madame Curie Bioscience [Internet]. Austin (TX): Landes Bioscience; 2000-2013.

Baza de date Bioscience Madame Curie [Internet].

Yoshihiro Urade, Naomi Eguchi și Osamu Hayaishi .

Autori

Afilieri

Introducere

figura 1

Calea biosintetică și metabolică a PGD2. cPLA2: fosfolipaza citosolică A2; TXA2: tromboxan A2.

Secvență de aminoacizi și structuri secundare și terțiare

ADNc pentru L-PGDS a fost mai întâi izolat dintr-o bibliotecă 10 de ADNc de creier de șobolan și ulterior din multe alte specii de mamifere, inclusiv omul 11 și șoarecele, 12 și, de asemenea, de la 2 amfibieni. 13, 14 ADNc pentru L-PGDS codifică o proteină compusă din 189 și 190 de resturi de aminoacizi în șoareci și, respectiv, în enzima umană. Figura 2, prezintă alinierea secvenței enzimelor umane și șoarecilor. L-PGDS este modificat post-translațional prin scindarea unei peptide semnal hidrofobe N-terminale cuprinzând 24 și 22 de resturi de aminoacizi în șoarece și, respectiv, în enzima umană. Două situri de N-glicozilare la pozițiile Asn51 și Asn78 ale șoarecelor și ale enzimelor umane 10 sunt conservate în toate enzimele mamiferelor identificate până acum, dar nu au fost găsite în omologii amfibieni. L-PGDS de mamifere este puternic glicozilat cu 2 lanțuri de zahăr N-glicozilate, fiecare cu o greutate moleculară de 3.000. Structurile glucidice ale L-PGDS au fost determinate în probe purificate din lichidul cefalorahidian uman (LCR), 15 ser, 16 urină 16, 17 și lichid amniotic. 17 Cu toate acestea, rămâne de stabilit semnificația funcțională a lanțurilor de zahăr.

Figura 2

Alinierea secvenței L-PGDS umane și de șoarece. Site-ul de scindare al secvenței semnal (săgeți), reziduul catalitic de cisteină (stea), o cistină (cercuri deschise) și 2 site-uri de glicozilare (cercuri închise) ale L-PGDS sunt prezentate în partea de sus a secvenței. Poziții (mai multe.)

Proprietățile chimice și structurale ale proteinelor L-PGDS au fost analizate utilizând proteina recombinantă heterologă exprimată în E. coli sau drojdie. L-PGDS este o enzimă foarte stabilă și este extrem de rezistentă la tratamentul termic 1 și la digestia proteazei. 18 De exemplu, mai mult de 50% din activitate a fost reținută după încălzirea enzimei timp de 5 minute la 100 ° C și pH alcalin. 1 L-PGDS a fost aproape complet repliat prin diluarea și răcirea enzimei denaturate cu 1% SDS la 100 ° C timp de 10 min sau cu clorhidrat de guanidină 6 M. 19 Astfel, L-PGDS este o proteină interesantă pentru studiul replierii proteinelor.

Spectroscopia circulară cu dicroism a șobolanului L-PGDS recombinant a arătat că enzima este compusă în principal din catene β, 19 asemănătoare cu alte lipocaline. Am cristalizat deja șoarece L-PGDS recombinant. Cu toate acestea, calitatea datelor de difracție cu raze X obținute de la cristalele pregătite inițial au fost insuficiente pentru a determina coordonatele fiabile ale L-PGDS. Cel mai recent, modificând condițiile de cristalizare și folosind mutantul selenometionil Cys65Ala, 20 am determinat cu succes structura cristalografică cu raze X a L-PGDS cu 2 conformeri diferiți ai calicelor deschise și închise la rezoluția 2.1Å (Kumasaka T, Irikura D, Ago H, Aritake K, Yamamoto M, Miyano M, YU și OH, rezultate nepublicate). Analiza cristalografică cu raze X a dezvăluit că L-PGDS posedă o structură tipică a plicului de lipocalină, β-butoi. Cu toate acestea, L-PGDS conține 2 buzunare hidrofobe; unul este situsul catalitic corespunzător buzunarului de legare a ligandului altor lipocaline și celălalt, situsul de legare a ligandului lipofil, situat pe partea moleculei L-PGDS opusă celei care conține situsul de legare a retinoidului.

Proprietăți de legare a ligandului

Similar cu alte lipocaline, L-PGDS leagă retinoizii, 21 bilirubina și biliverdina 22 cu afinități mari (Kd = 30-80 nM). Prin monitorizarea stingerii fluorescenței intrinseci a triptofanului L-PGDS și prin spectroscopie circulară cu dicroism a liganzilor legați, am arătat că L-PGDS leagă acidul all-trans- sau 9-cis-retinoic și all-trans- sau 13-cis -retinaldehidă, dar nu tot-trans-retinol, la un raport molar de 1: 1 cu un Kd de 70 la 80 nM. 21 Afinitățile L-PGDS pentru retinoizi sunt comparabile sau puțin mai mari decât cele ale altor lipocaline care acționează ca transportori retinoizi extracelulari, cum ar fi β-lactoglobulina, proteina de legare a retinolului plasmatic și proteina de legare a acidului retinoic plasmatic (revizuită în alte capitole ). L-PGDS leagă, de asemenea, hormonul tiroidian cu un Kd de 0,7-2 μM și biliverdină și bilirubină cu afinități mari, adică cu un Kd de 30-40 nM. 22 Am descoperit recent că L-PGDS își leagă produsul PGD2 cu afinitate ridicată (Kd de 20 nM; Aritake K, YU; rezultate nepublicate), sugerând că L-PGDS acționează nu numai ca o enzimă producătoare de PGD2, ci și ca o extracelulară transportator de PGD2 pentru a preveni metabolismul și deshidratarea neenzimatică a acestuia.

Dintre acei liganzi hidrofobi nesubstrat, retinoizi, 21 bilirubină și biliverdină 22 au inhibat activitatea PGDS într-o manieră necompetitivă. Cu toate acestea, potențialele lor inhibitorii au fost remarcabil de slabe (IC50 = 4 ~ 10 μM), spre deosebire de afinitățile lor ridicate (Kd = 30-80 nM) de legare la L-PGDS, evaluate prin stingerea fluorescenței intrinseci a triptofanului. Prin urmare, situsul catalitic și situsul de legare pentru acei liganzi hidrofobi sunt considerați diferiți unul de celălalt. Pe de altă parte, am prezis că PGD2 este legat de buzunarul catalitic. Două buzunare distincte de legare au fost identificate în cele din urmă prin studiul cristalografic al L-PGDS de șoarece, așa cum este descris mai sus.

Prin urmare, propunem că L-PGDS este o proteină multifuncțională; acționează ca o enzimă producătoare de PGD2 prin cuplarea cu ciclooxigenaza-1 sau -2, enzimele din amonte în cascada PG, în interiorul celulelor și funcționează și ca proteină lipofilă de legare a ligandului după ce a fost secretată în spațiile extracelulare și în diferitele corpuri lichide. Așa cum este descris în paragraful următor, PGD2 este mai puțin stabil chimic decât PGE2 sau PGF2α, fiind deshidratat în seria J de PG-uri. Odată legat de L-PGDS, PGD2 este stabilizat remarcabil pentru a încetini conversia la PG-urile din seria J. Mai mult, afinitatea de legare a L-PGDS pentru PGD2 este ușor mai slabă decât acele afinități a 2 tipuri distincte de receptori PGD2, adică, tipul D al receptorilor prostanoizi (DP, DP1) și CRTH2 (DP2). Prin urmare, prezicem că L-PGDS leagă PGD2 instabil chimic, transportă PGD2 în spațiul extracelular către locurile de acțiune și transferă PGD2 către receptorii săi.

Proprietăți enzimatice ca PGD sintază

L-PGDS este prima lipocalină recunoscută ca enzimă. L-PGDS a fost inițial purificat din creierul de șobolan 1 ca PGD sintază (PGH2 D-izomerază, EC 5.3.99.2), care catalizează izomerizarea grupului 9,11-endoperoxid de PGH2, un precursor comun al diferitelor prostanoide, pentru a produce PGD2 cu grupări 9-hidroxi și 11-ceto în prezența compușilor sulfhidril. PGD2 este PG-ul principal produs în sistemul nervos central al diferitelor mamifere și este implicat în reglarea somnului 23, 24 și a nocicepției12 prin receptorii DP (DP1). 25, 26 PGD2 este, de asemenea, produs și secretat activ de mastocite, 18 bazofile și celule Th2 27 de H-PGDS evolutiv diferite, 6 - 8 acționând ca un mediator alergic și inflamator prin DP (DP1) 25, 28 și CRTH2 DP2 ) 29 de receptori într-o manieră autocrină și/sau paracrină.