Profilarea transcriptomului relevă modificări semnificative ale musculaturii gastrice externe cu obezitate
Abstract
fundal
Golirea gastrică este afectată la pacienții cu gastropareză, în timp ce este fie neschimbată, fie accelerată la persoanele obeze. Scopul studiului actual a fost de a identifica modificările exprimării genelor la nivelul stomacului muscular care pot contribui la modificarea motilității gastrice în gastropareza idiopatică și obezitate.
Metode
RT-PCR cantitativ în timp real și secvențierea transcriptomului întreg au fost folosite pentru a compara transcriptomii indivizilor slabi, indivizilor obezi și indivizilor slabi sau obezi cu gastropareză idiopatică.
Rezultate
Obezitatea duce la o creștere a ARNm asociate cu contractilitatea musculară, în timp ce gastropareza idiopatică duce la o scădere a ARNm asociate cu semnalizarea PDGF BB. Atât obezitatea, cât și gastropareza idiopatică au fost, de asemenea, asociate cu modificări similare ale căilor asociate cu inflamația.
Concluzii
Rezultatele noastre arată că obezitatea și gastropareza idiopatică duc la modificări suprapuse, dar distincte, ale transcriptomului muscularului gastric. Exprimarea crescută a ARNm care codifică proteinele contractile ale mușchiului neted poate contribui la motilitatea gastrică crescută observată la subiecții obezi, în timp ce semnalizarea scăzută a PDGF BB poate contribui la motilitatea afectată observată la subiecții cu gastropareză idiopatică.
fundal
Metode
Evaluare clinică
Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu protocolul aprobat de Consiliul de revizuire instituțională a Universității Indiana. Au fost obținute consimțământuri informate de la subiecții martor și pacienții cu gastropareză idiopatică. Gastropareza idiopatică a fost definită ca pacienți cu simptome de gastropareză ≥ 3 luni cu golire gastrică întârziată prin scintigrafie gastrică de 4 ore sau prezența unui bezoar gastric cu alimente nedigerate prin endoscopie superioară după un post peste noapte. Scintigrafia gastrică a fost efectuată după consumul unei mese cu albuș de ou cu conținut scăzut de grăsimi, cu imagistica la 0, 2 și 4 ore, după cum sa descris anterior [18, 19]. Golirea gastrică anormală a fost definită ca retenție de 2 ore ≥60% sau retenție de 4 ore ≥10%. Pacienții cu gastropareză incluși în studiu nu au avut diabet zaharat, determinat de glucoza de post normală sau hemoglobina normală A1c (HbA1c) prin test de sânge. Am exclus, de asemenea, subiecții cu alte boli sistemice, cum ar fi intervenția chirurgicală cu traume vagale, sclerodermia, tulburarea mixtă a țesutului conjunctiv și sindromul paraneoplazic.
Biopsii stomacale cu grosime completă
Biopsii din grupul de control al IMC scăzut (fără diabet raportat sau gastropareză) au fost obținute de la donatori de transplant de organe în momentul transplantului de organe. Biopsiile din grupul de control al IMC ridicat au fost obținute de la indivizi nediabetici fără simptome gastropareze care au fost supuși unei intervenții chirurgicale de scădere în greutate bariatrică (nivel normal de HbA1c 7. Nivelurile de ATP4A și gastrin mRNA au fost analizate în toate probele prin qRT-PCR pentru a depista contaminarea mucoasei Pentru analize ulterioare au fost utilizate numai probele care au avut niveluri de expresie ale acestor markeri care au fost de mai puțin de 100 de ori mai mici decât nivelurile prezente în mucoasă.
Pregătirea și secvențierea bibliotecii
Concentrația și calitatea probelor totale de ARN au fost evaluate mai întâi utilizând Agilent 2100 Bioanalyzer. Un RIN (RNA Integrity Number) de 7 sau mai mare a fost necesar pentru a trece controlul calității. Apoi, 200 ng de ARN pe probă au fost folosite pentru a prepara o bibliotecă de ADNc cu catenă specifică dublă indexată utilizând KAPA mRNA Hyperprep Kit (Roche). Bibliotecile rezultate au fost evaluate pentru distribuția cantității și dimensiunilor lor folosind Qubit și Agilent 2100 Bioanalyzer. Au fost utilizate două sute de biblioteci pico molare grupate pe celulă de flux pentru amplificarea clusterelor pe cBot folosind HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit și secvențiate cu o configurație asociată de 2,75 bp pe HiSeq4000 (Illumina) folosind HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit. Un scor de calitate Phred (scor Q) a fost utilizat pentru a măsura calitatea secvențierii. Mai mult de 90% din citirile secvențiale au atins Q30 (99,9% acuratețea apelului de bază). Secvențierea a fost efectuată în Centrul de Genomică Medicală (CMG) de la Școala de Medicină a Universității Indiana, o unitate de bază de secvențiere a Indiana CTSI.
Alinierea secvenței și numărul de gene
Datele de secvențiere au fost evaluate mai întâi folosind FastQC (Babraham Bioinformatics, Cambridge, Marea Britanie) pentru controlul calității. Apoi toate bibliotecile secvențiate au fost mapate la genomul uman (UCSC hg38) folosind alinierea STAR RNA-seq [20] cu următorul parametru: „--outSAMmapqUnique 60”. Distribuția citirilor în genom a fost evaluată folosind bamutils (de la ngsutils) [21]. Citirile secvențiale mapate unic au fost atribuite genelor refgene hg38 folosind featureCounts (din subcitire) cu următorii parametri: „-s 2 –p –Q 10” [22]. Controlul calității rezultatelor secvențierii și mapării a fost rezumat folosind MultiQC [23]. Au fost păstrate gene cu număr citit per milion (CPM)> 0,5 în mai mult de 4 dintre probe. Datele au fost normalizate utilizând metoda TMM (media tăiată a valorilor M). Numărul mediu de citiri cartografiate în mod unic obținute pe eșantion a fost de 28,7 milioane (86,96% din lecturile brute), cu un minim de 22,3 milioane și un maxim de 32 de milioane. Analiza expresiei diferențiale a fost efectuată folosind edgeR [24, 25]. Rata de descoperire falsă (FDR) a fost calculată din -valorile folosind procedura Benjamini-Hochberg. Datele complete de secvențiere a ARN sunt disponibile din baza de date NCBI GEO, numărul de acces GSE129398.
qRT-PCR. 500 ng de ARN au fost utilizate în reacțiile de transcripție inversă (trusă de înaltă capacitate RT-cDNA, Life Technologies). PCR în timp real a fost efectuat folosind Sybr Green (Roche). Nivelurile de expresie a ARNm au fost normalizate la expresia proteinei de legare TATA (TBP) ca un control intern și sunt exprimate în raport cu valorile medii observate în probele de la pacienții cu IMC scăzut de control. Primerii utilizați pentru qRT-PCR sunt enumerați în fișierul suplimentar 4: Tabelul S1