Producția de acid L () - acid lactic folosind ciuperci de poli (alcool vinilic - criogel - Rhizopus oryzae prinse

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia === Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia

UN. Institutul de compuși organoelementali Nesmeyanov, Academia Rusă de Științe, str. Vavilov, 28, 119991 Moscova, Rusia

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia

UN. Institutul de compuși organoelementali Nesmeyanov, Academia Rusă de Științe, str. Vavilov, 28, 119991 Moscova, Rusia

Prezentat parțial la reuniunea COST privind Bioincapsularea (Belgrad, iunie 2004)

Abstract

INTRODUCERE

În prezent, producția de acid lactic (LA), care este utilizat pe scară largă în diverse zone, continuă să crească. 1 În acest sens, sunt de interes deosebit noile abordări biotehnologice ale intensificării producției de LA, precum și căutarea de noi producători microbieni. Diferite tulpini bacteriene au fost utilizate pentru fermentarea LA, dar toate necesită medii nutritive bogate, cu valori ale pH-ului de cel puțin 5,5. În aceste condiții, apare creșterea celulelor; prin urmare, o mare parte a nutrienților este consumată pentru acumularea de biomasă celulară și nu pentru sinteza produsului. Astfel, concentrația finală a produsului țintă (și anume LA) este mai mică decât se poate obține în absența creșterii celulare. Pe de altă parte, implementarea ciupercilor în locul bacteriilor ca producători de LA este foarte atractivă, 3 deoarece ciupercile sunt rezistente la concentrații mari de LA acumulată. 4, 5 De asemenea, contrar bacteriilor, care produc amestecuri racemice de forme D (-) și L (+) - LA, ciupercile permit producerea de L (+) - LA practic pur.

MATERIALE ȘI METODE

Amidonul de cartof (cel mai înalt grad) și PVA (marca comercială 16/1) utilizate în lucrare au fost achiziționate de la fabrica de amidon Belinichi (Belinichi, Bielorusia) și respectiv NPO Azot (Severodonetsk, Ucraina), respectiv. Tulpina fungică Rhizopus oryzae NRRL - 395 a fost primit din Colecția Națională Rusă de Microorganisme Industriale. Sporii au fost crescuți pe mediu de dextroză 6 cu agar (2%).

Mărgele IBC cu diametrul de 1-1,5 mm au fost preparate prin prinderea R. oryzae spori în PVA - CG urmat de germinarea celulară conform procedurii brevetate. 11

Mediul cu glucoză utilizat pentru fermentarea LA a fost după cum urmează (g L -1): glucoză - până la 120, (NH4) 2SO4 - 3,0, MgSO4,7H2O - 0,3, ZnSO4,7H2O - 0,05, KH2PO4 - 0,2.

Pentru prepararea mediului pe bază de hidrolizat acid de amidon, acesta din urmă a fost lichefiat prin hidroliză acidă la 121 ° C timp de 1 oră cu neutralizare ulterioară cu hidroxid de sodiu. Cantitatea necesară de 2 mol L-1 HCI a fost de 0,5% (v/v). Hidrolizatul astfel obținut a fost analizat pentru concentrația de glucoză și îmbogățit cu următoarele săruri (g L -1): (NH4) 2SO4 - 3,02, MgSO4,7H2O - 0,25, ZnSO4,7H2O - 0,04, KH2PO4 - 0,15.

Pentru a efectua fermentația LA folosind amidon nativ ca substrat principal, amidonul de cartofi a fost gelatinizat la 70 ° C timp de 5 min. S-au adăugat aceleași săruri utilizate în experimentele cu hidrolizate de amidon pentru a prepara mediul de fermentare.

Cultivarea celulelor imobilizate a fost efectuată pe un agitator la 200 rpm, 28 ° C și pH 5,0-6,0. Margelele IBC au fost utilizate în procesele discontinue și semi-discontinue; IBC a fost spălat cu 20 mmol L-1 K/Na - tampon fosfat (pH 6,8) după fiecare ciclu discontinuu. Pentru a menține pH-ul la un nivel optim, carbonatul de calciu (5-10 g L -1), sterilizat anterior într-o formă uscată, a fost adăugat la mediul de fermentație înainte de cultivare.

Concentrația de celule imobilizate a fost calculată în conformitate cu procedura cunoscută. 4

Productivitatea procesului a fost determinată ca cantitatea de LA solubilă și precipitată care s-a acumulat în bulion pe parcursul întregului proces. Înainte de analiză, precipitatul lactatului de calciu a fost transformat în forma solubilă prin adăugare de acid sulfuric. Concentrația totală de LA a fost determinată prin HPLC (Econo System, Bio-Rad) utilizând o coloană de excludere a ionilor Aminex HPX-87H. Eluantul, 2 mmol L -1 acid benzoic, a fost utilizat la un debit de 0,7 ml min -1, iar temperatura coloanei a fost de 80 ° C. Concentrația de amidon a fost analizată prin metoda colorimetrică de iod. Concentrațiile izomerului L (+) - LA și ale glucozei au fost testate prin metode enzimatice folosind un kit L (+) - lactat oxidază - peroxidază (Sentinel, Italia) și respectiv kit glucozoxidază - peroxidază (Impact, Rusia), respectiv.

REZULTATE SI DISCUTII

Pregătirea biocatalizatorului imobilizat

Procedura de preparare a IBC pe bază de celule fungice prinse în criogel PVA a constat în două etape principale: (i) prinderea R. oryzae spori din matricea criogelului și (ii) vegetația celulelor fungice din interiorul granulelor de gel până la starea de echilibru. PVA - CG a fost ales ca purtător de imobilizare deoarece această matrice, în ciuda porozității sale ridicate (care asigură difuzia neîmpiedicată a substraturilor și a metaboliților de orice greutate moleculară), posedă proprietăți mecanice foarte bune și o sensibilitate scăzută la eroziunea abrazivă chiar și în reactoare cu agitare foarte intensă. 8-10 Mărimea macroporilor (secțiunea transversală de aproximativ 1-2 µm) și arhitectura interconectată a acestora oferă suficient spațiu pentru creșterea miceliului înglobat în gel în a doua etapă (ii) a formării IBC. Acest lucru poate fi văzut clar în Fig. 1, care prezintă o imagine SEM a unei regiuni interioare a unei mărgele IBC. Această cifră confirmă, de asemenea, că nu apar limitări în timpul creșterii celulare în ceea ce privește nutrienții și oxigenul pentru această tulpină aerobă imobilizată, deoarece s-a format miceliu bine dezvoltat.