P38SJ, o nouă proteină DINGG protejează celulele neuronale de leziunile provocate de alcool și de moarte
Shohreh Amini
1 Departamentul de Neuroștiințe, Centrul pentru Neurovirologie, Temple University School of Medicine Philadelphia, Pennsylvania
2 Departamentul de Biologie, Colegiul de Știință și Tehnologie, Universitatea Temple Philadelphia, Pennsylvania
Nana Merabova
1 Departamentul de Neuroștiințe, Centrul pentru Neurovirologie, Temple University School of Medicine Philadelphia, Pennsylvania
Kamel Khalili
1 Departamentul de Neuroștiințe, Centrul de Neurovirologie, Temple University School of Medicine Philadelphia, Pennsylvania
Nune Darbinian
1 Departamentul de Neuroștiințe, Centrul pentru Neurovirologie, Temple University School of Medicine Philadelphia, Pennsylvania
Abstract
Etanolul induce leziuni ale celulelor neuronale și moartea prin neregularizarea mai multor evenimente de semnalizare care sunt controlate, parțial, prin activarea MAPK/ERK1/2 și/sau prin inactivarea fosfatazei sale corespunzătoare, PP1. Recent, am purificat o nouă proteină de 38 kDa în mărime, p38SJ, dintr-o cultură de calus a Hypericum perforatum, care aparține unei familii emergente de proteine DINGG cu activitate de legare a fosfatului. Aici, arătăm că tratamentul celulelor neuronale cu p38SJ protejează celulele împotriva leziunilor induse de expunerea la etanol. Mai mult, tratamentul prealabil al celulelor neuronale cu p38SJ reduce nivelul proteinei pro-apoptotice Bax și unele evenimente asociate cu apoptoza, cum ar fi clivarea caspazei 3. În plus, prin inducerea stresului, alcoolul poate crește producția de specii reactive de oxigen (ROS) care duce la o scădere a activității superoxidului dismutazei (SOD). Rezultatele noastre au arătat că p38SJ restabilește activitatea SOD în celulele neuronale tratate cu etanol. Aceste observații oferă un nou instrument biologic pentru dezvoltarea de noi abordări pentru prevenirea morții celulelor neuronale induse de etanol și, eventual, tratarea tulburărilor neurologice asociate cu abuzul de alcool.
INTRODUCERE
Abuzul de alcool este asociat cu multiple deficite neurologice și comportamentale, inclusiv neuropatie și encefalopatie, degenerare cerebeloasă, modificări cognitive și afectarea judecății și a memoriei (pentru o revizuire a se vedea Alderazi și Brett 2007; Brun și Andersson 2001; Brust 2008; Johnson și colab., 1986). Etanolul dăunează sistemului nervos și provoacă leziuni ale celulelor neuronale prin afectarea mai multor căi de transducție a semnalului, inclusiv MAPK (Sanna și colab., 2002, Logrip 2008). Activarea MAPK de către etanol este dependentă de receptor. Printre receptorii afectați de etanol se numără receptorii GABA (Lee și colab., 2007a, Ueno 2001). S-a demonstrat că efectele celulare ale etanolului care apar prin modularea căilor de transcripție PKA și CREB sunt activate prin receptorii GABA (Criswell și Breese, 2005); expresia crescută a PKA și CREB a fost observată după tratamentul cu etanol (Pandey și colab., 2001).
Studiile anterioare au demonstrat că etanolul poate provoca moartea celulelor neuronale prin stres oxidativ (Antonio și colab., 2008; Haorah și colab., 2008a; Heaton și colab., 2002, 2003; Lee și colab., 2007; Ramachandran și colab., 2003; Watts și colab., 2005). Studii recente au indicat, de asemenea, niveluri crescute de ROS în SNC ale alcoolicilor, probabil datorită metabolismului etanolului (Haorah și colab., 2008a). Stresul oxidativ indus de alcool în creier a fost studiat pe larg ca o cale nouă de neurodegenerare asociată cu abuzul de alcool (Haorah și colab., 2008a și b). Multe studii bine dezvoltate indică importanța activării kinazelor și a inhibării fosfatazelor în leziunile celulare cauzate de stresul oxidativ indus de etanol în creier (Haorah și colab., 2005, 2007, 2008b; Lohmann 2004). Mecanismele potențiale care conduc la inducerea stresului oxidativ și producerea de ROS indusă de alcool și, prin urmare, la leziuni neuronale nu sunt pe deplin înțelese.
Recent am identificat o nouă proteină de 38 kDa, p38SJ, dintr-o cultură de calus cultivată in vitro de Hypericum perforatum și am clonat ADNc-ul său parțial, p27SJ. p27SJ aparține familiei de proteine DINGG, deoarece conține o secvență conservată DINGG la capătul N-terminal (Darbinian și colab., 2008; Perera și colab., 2008). p27SJ prezintă capacitatea de a modula expresia genelor virale și celulare, inclusiv HIV-1, MCP-1 (Darbinian-Sarkissian și colab., 2006; Mukerjee și colab., 2008),
La om, o peptidă care conține DINGG a fost identificată pentru prima dată în lichidul sinovial și s-a constatat că face parte dintr-o proteină mai mare cunoscută sub numele de proteină stimulatoare a celulelor T sinoviale p205 (Blass și colab, 1999; Hain și colab, 1996). Studiile ulterioare au condus la identificarea unui alt membru al familiei umane DINGG cu efecte care favorizează creșterea în celulele normale și tumorale (Adams și colab., 2002; Belenky și colab., 2003; Morales și colab., 2006). În plus față de țesutul uman, proteinele DINGG au fost izolate din diferite ciuperci, țesuturi animale și vegetale și prezintă o omologie strânsă cu proteinele Pseudomonas (pentru recenzie vezi Ahn și colab., 2007; Berna și colab., 2002, 2008; Chen și colab., 2007; Lewis și Crowther, 2005; Moniot și colab., 2007; Pantazaki și colab., 2007; Riah și colab., 2000; Scott și Wu, 2005).
Aici demonstrăm că tratamentul celulelor neuronale cu p38SJ le protejează de apoptoza indusă de etanol.
MATERIALE ȘI METODE
Cultură de celule
Neuronii corticali de șobolan s-au propagat în urma tratamentului enzimatic și mecanic al țesutului embrionar de șobolan Sprague Dawley în ziua 17 (E17) folosind enzima TrypleExpress (Invitrogen, Carlsbad, CA) la 37 ° C timp de 10 minute, urmată de trei spălări cu mediu Hibernate E. După tratamentul mecanic al țesutului cu o pipetă Pasteur din sticlă lustruită cu foc, suspensia monocelulară a fost diluată cu mediu de cultură și celulele au fost placate pe vase de 60 mm acoperite cu poli-D-lizină cu o densitate de 2,5 × 106/placă și cultivate 3 ml mediu neurobazal care conține supliment B27, 0,25 mM Glutamax și 0,25 mM L-glutamină (toate de la Invitrogen). Celulele au fost menținute la 37 ° C într-un incubator umidificat conținând 7% CO2.
Microscopie
Imaginile cu contrast de fază ale celulelor neuronale au fost vizualizate cu un microscop de fluorescență Olympus inversat utilizând software-ul IPLAB. Contrastul și luminozitatea au fost ajustate în mod egal pentru toate imaginile folosind Adobe Photoshop versiunea 5.5.
Pregătirea extractului de plante
O sută de miligrame de H. perforatum uscat au fost dizolvate în 1 ml de tampon de liză conținând 30 mM Tris (pH 7,4), 167 mM NaCl, 0,1% Nonidet P-40 și cocktail inhibitori de protează (Sigma, St. Louis, MO SUA). Resturile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare la 14.000 rpm timp de 5 minute la 4 ° C. Proteinele solubile totale din cal au fost centrifugate la 10.000 rpm timp de 5 minute și supernatantul a fost recuperat și fracționat prin filtre Microcon 3, 30 și 50 kDa MilliPore (Millipore, Billerica, MA SUA), pentru a separa proteina de 38 kDa de molecula joasă proteine de greutate și alte componente organice vegetale. Puritatea proteinei de 38 kDa a fost determinată prin SDS-PAGE.