Ontogeneza metabolismului glucozei la păstrăvul curcubeu (Oncorhynchus mykiss) în lumina recentului

ABSTRACT

INTRODUCERE

Scopul prezentului studiu a fost analizarea genelor metabolismului glucozei, adică gene aparținând celor două căi principale legate de glucoză: glicoliză și gluconeogeneză (Fig. S1), pentru: (i) identificarea și caracterizarea evoluției genelor de glicoliză duplicate în păstrăv curcubeu (adică fosfofructokinază hepatică și piruvat kinazic hepatic); (ii) determinați modelul de expresie al genelor duplicate legate de metabolismul glucozei, adică gene glicolitice (paralogi de glucokinază, gcka și gckb; paralogi de fosfofructokinază hepatică, pfkla și pfklb; piruvat kinază hepatică și de celule roșii din sânge, pklr) și gene gluconeogene (fosfenol citosolic și mitocondrial piruvat carboxicinază p1b1 și pb1 p1 și fbp1b2; paralogii glucozei 6-fosfatazei g6pca, g6pcb1.a, g6pcb1.b, g6pcb2.a și g6pcb2.b), precum și activitatea lor enzimatică globală corespunzătoare în stadii critice de dezvoltare în ontogeneza ficatului; și (iii) studiați modelul de expresie al acestor gene în timpul tranziției nutriționale de la hrănirea endogenă la cea exogenă la păstrăvul hrănit cu o dietă care nu conține carbohidrați sau cu un conținut ridicat de carbohidrați.

metabolismului

MATERIALE ȘI METODE

Declarație de etică

Experimentul a fost realizat în strictă conformitate cu cadrele legale ale UE referitoare la protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (Directiva 2010/63/UE) și orientările legislației franceze care reglementează tratamentul etic al animalelor (decretul nr. 2001-464, 29 mai 2001). Acesta a fost aprobat de Direction Departementale des Services Veterinaires (Serviciile veterinare franceze) pentru efectuarea de experimente pe animale (INRA 2002–36, 14 aprilie 2002). Stația experimentală INRA este certificată pentru experimentare pe animale sub autorizația nr. A64.495.1 de către Serviciile veterinare franceze, autoritatea relevantă.

Dietele de pește

Două hrană experimentală pentru aluvinele de păstrăv curcubeu, adică no-CHO (dietă fără carbohidrați) și high-CHO (dietă cu carbohidrați foarte ridicați), au fost preparate în propriile instalații (INRA, Donzacq, Landes, Franța) sub formă de pelete extrudate. Glucoza și amidonul gelatinizat au fost incluse ca surse de carbohidrați; proteine ​​provenite din făină de pește și lipide alimentare din ulei de pește și făină de pește (Tabelul 1). Cele două diete au avut cantități similare de lipide. Creșterea mare a conținutului de carbohidrați din dietă (~ 60%) în dieta bogată în CHO a fost compensată de o proporție mai mică de proteine ​​(~ 20%). Nu s-au adăugat carbohidrați la dieta fără CHO, care conținea aproximativ 60% proteine ​​brute.

Formularea și compoziția apropiată a celor două diete experimentale (fără CHO și cu conținut ridicat de CHO)

Pește și design experimental

Analiza dietelor

Compoziția chimică a dietelor a fost analizată folosind următoarele proceduri: substanța uscată a fost analizată după uscare la 105 ° C timp de 24 de ore, conținutul de lipide a fost obținut prin extracție cu eter de petrol (Soxtherm), conținutul de proteine ​​(N × 6,25) a fost obținut prin Metoda Kjeldahl după digestia acidă, energia brută a fost măsurată într-un calorimetru cu bombă adiabatică (IKA, Heitersheim Gribheimer, Germania), iar conținutul de cenușă a fost măsurat prin incinerarea probelor într-un cuptor cu mufla timp de 6 ore la 600 ° C.

Analiza compoziției corpului a ovocitelor, embrionilor și alevinelor de hrănire endogene

Conținutul de glicogen și glucoză a fost analizat la 600 mg de pești în grup (ovocite, embrioni din stadiul 2 până în stadiul 23 și alevine de hrănire endogenă, stadiul 31). Conținutul de glicogen a fost determinat printr-o tehnică de hidroliză descrisă anterior de Good et al. (1933). Fiecare probă a fost măcinată în 1 mol l-1 HCI (VWR, SUA). O alicotă a fost salvată în această etapă pentru a măsura conținutul de glucoză liberă. După 10 min de centrifugare la 10.000 g, glucoza liberă a fost măsurată folosind trusa de cantitare a glucozei fluorimetrică Amplite ™ (AAT Bioquest ®, Inc., SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Restul de țesut măcinat a fost fiert la 100 ° C timp de 2,5 ore și apoi neutralizat cu 5 mol l -1 KOH (VWR, SUA). PH-ul soluției a fost apoi ajustat la 7,4 și glucoza totală (glucoză liberă + glucoză obținută din hidroliza glicogenului) a fost măsurată folosind același kit ca înainte. Conținutul de glicogen a fost evaluat prin scăderea nivelului de glucoză liberă.

Conținutul total de lipide a fost determinat în duplicat prin metoda sulfofosfovanilun descrisă de Barnes și Blackstock (1973) utilizând un standard de ulei de pește (Sopropeche, Boulogne-sur-Mer, Franța) în loc de colesterol.

Conținutul total de proteine ​​a fost, de asemenea, măsurat în duplicat, utilizând metoda Kjeldahl ca și pentru analiza dietetică.

Analiza in silico

Genele ortologe pfkl și pklr din genomul păstrăvului curcubeu (Berthelot și colab., 2014) au fost identificate în browserul genomului Oncorhynchus mykiss (Genoscop: http://www.genoscope.cns.fr/trout/) extras din baza de date SIGENAE ( http://www.sigenae.org) folosind instrumentul BLAST (toate numerele de acces sunt date în Tabelul 2). Secvențele de la alte specii au fost colectate din baza de date Ensembl Genome (versiunea Ensembl 77, octombrie 2014: http://www.ensembl.org). Instrumentul de analiză a secvențelor din software-ul EMBL Pfam (http://pfam.xfam.org) a fost utilizat pentru a confirma identitățile secvenței. Software-ul Genomicus, v01.01 (http://www.genomicus.biologie.ens.fr/genomicus-trout-01.01/cgi-bin/search.pl) a fost utilizat pentru a confirma identitatea genelor pfkl.