Nanobiosenzori pe bază de FRET pentru microdomenii intracelulare Ca2 și H

Alsu I. Zamaleeva

1 Ecole Normale Supérieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Inserm U1024, CNRS UMR 8197, Paris F-75005, Franța; E-mailuri: [email protected] (A.I.Z.); [email protected] (C.L.)

Guillaume Despras

2 Departamentul de chimie, École Normale Supérieure-PSL Research University, CNRS UMR 7203 LBM, 24, rue Lhomond, and Sorbonne University, UPMC Univ Paris 06 LBM, 4 place Jussieu, Paris F-75005, France; E-mailuri: ed.leik-inu.co@sarpsedg (G.D.); [email protected] (M.C.); [email protected] (J.-M.M.)

Camilla Luccardini

1 Ecole Normale Supérieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Inserm U1024, CNRS UMR 8197, Paris F-75005, Franța; E-mailuri: [email protected] (A.I.Z.); [email protected] (C.L.)

Mayeul Collot

Michel de Waard

3 Inserm U836, Grenoble Neuroscience Institute, Research Group 3, LabEx Ion Channel Science and Therapeutics, Universitatea Joseph Fourier, BP170, Grenoble Cedex 09 38042, Franța; E-mail: [email protected]

Martin Oheim

4 Laborator de fiziologie a creierului, CNRS UMR 8118, Faculté des Sciences Fondamentales et Biomédicales, Fédération de Neurosciences FR3636, Paris Descartes University, PRES Sorbonne Paris Cité, Paris F-75006, France; E-mail: [email protected]

Jean-Maurice Mallet

Anne Feltz

1 Ecole Normale Supérieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Inserm U1024, CNRS UMR 8197, Paris F-75005, Franța; E-mailuri: [email protected] (A.I.Z.); [email protected] (C.L.)

Date asociate

Abstract

1. Introducere

Pentru a îndeplini mai bine condițiile de detectare a microdomeniului ionic, propunem aici utilizarea unei nanoparticule fluorescente și multifuncționalizate, care transportă mai multe molecule senzorice de ioni, precum și peptide cu penetrare celulară (CPP) pentru a facilita livrarea citoplasmatică a acestuia. Am folosit un punct cuantic comercial (QD), adică o particulă fluorescentă coloidală anorganică ca schelă centrală pentru biosenzorul nostru. Spectrul larg de absorbție, spectrul de emisie simetric bine definit și luminozitatea mare și rezistența ridicată la albire fotocalică în comparație cu fluoroforii organici cu molecule mici fac din QD donatori de energie buni pentru transferul de energie prin rezonanță de fluorescență (FRET) și facilitează detectarea QD-urilor unice în interior celule. Câteva molecule indicator ionice organice legate de suprafața QD acționează ca acceptori de energie fluorescentă. Eficiența FRET a acestui ansamblu este dată de suprapunerea spectrului de emisie al QD cu spectrul de absorbanță al indicatorului de ioni fluorescenți, precum și de numărul, orientarea și proximitatea acestora cu suprafața QD.

Raportăm aici sinteza, caracterizarea și validarea unei perechi de FRET pe bază de rubin QD/Ca (H) și demonstrăm că Rubinul Ca (H) legat titrează împotriva Ca 2+/protonii ca vopsea liberă în soluție. În cele din urmă, validăm atât in vitro, cât și in situ, o celulă bazată pe FRET care pătrunde nanobiosenzorul Ca 2+, precum și un nanobiosensor H + înghițit de calea endocitotică.

1.1. Material si metode

Chimia compușilor CaRuby1 și HRubies va fi găsită în [17] și, respectiv, [19]. Chimia CaRuby2 este descrisă în Informații suplimentare și documentată cu Schema S1 pentru strategia sintetică și Figurile S1 - S46 pentru caracterizarea intermediarilor de sinteză și a compușilor finali.

Majoritatea protocoalelor utilizate aici (pentru chimia suprafeței QD-urilor, condițiile pentru menținerea liniei celulare BHK care exprimă stabil NR2A-NMDAR și utilizarea lor pentru microscopia TIRF) au fost descrise anterior în Informațiile de susținere ale Zamaleeva și colab., 2014 [8] până la care se va referi la sinteza QD-urilor acoperite cu peptide, funcționalizarea QD-urilor și purificarea lor, cultura celulară a liniei celulare BHK care exprimă NR2-NMDAR și imagistica în celule a particulelor individuale utilizând microscopia TIRF. În principal descriem aici protocoalele relevante pentru studiul nanosenzorilor de pH pe bază de HRu-PiAC.

1.2. PEGilarea coloranților

PEGilarea CaRubies utilizând lanțul lateral pentru chimia clicurilor a fost detaliată de [8]. Aceeași procedură de PEGilare a fost urmată pentru HRu-PiAC.

1.3. Fluorimetre

Metodele utilizate pentru CaRubies2 au fost publicate anterior [18]. Pe scurt, intervalul dinamic CaRuby pentru detectarea Ca 2+ a fost estimat din vârful PL de CaRuby măsurat într-o soluție conținând (în mM) 100 KCl, 30 MOPS, unde [Ca 2+] a fost ajustat folosind kitul Invitrogen Ca Buffer (Life Technologies, ref: C-3008MP). Pentru titrarea HR-PiAC am utilizat tamponul universal de pH, vezi Suplimentarul 3, p. 830 în [20] care are o forță ionică aproape constantă în intervalul de 2 până la 12 pH. Curbele de fluorescență sunt corectate pentru sensibilitatea la pH a fluorescenței QD (a se vedea figura S3 pentru detalii). Spectrele de fluorescență FRET (500-700 nm) au fost obținute prin lumină de excitație la 407 nm, iar spectrele de emisie directă (550-700 nm) au fost obținute prin excitație la 545 nm. Toate valorile pentru perechile FRET au fost calculate, după amestecarea liniară spectrală, prin potrivirea la spectrele QD și Ca/HRuby (instrumentul de montare a curbei MatLab).