Model de metilare a ADN la femeile supraponderale în cadrul unei diete cu restricții energetice suplimentate cu pește

1 Departamentul de nutriție, științe alimentare și fiziologie, Universitatea din Navarra, C/Irunlarrea 1, 31008 Pamplona, ​​Spania

2 Departamentul de Fiziologie și Biofizică, Institutul de Științe Biomedice, Universitatea din São Paulo, Avenue Professor Lineu Prestes, 1524, 05508-900 São Paulo, SP, Brazilia

3 CIBER Fiziopatologia obezității și nutriției (CIBERobn), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Spania

Abstract

1. Introducere

Prin urmare, scopul prezentului studiu a fost de a testa ipoteza dacă suplimentarea cu ulei de pește într-un tratament dietetic cu restricție de energie afectează modelul de metilare a ADN-ului genelor care sunt reglementate în jos de -3 Suplimentarea PUFA în PBMC, cum ar fi receptorii de acizi grași CD36 și FFAR3, enzimele FADS1 și PDK4, și antigenul de suprafață CD14.

2. Metode

2.1. Proiectare de încercare și participanți

Studiul primar s-a bazat pe un studiu randomizat de 8 săptămâni de intervenție cu patru diete izocalorice, conceput pentru a investiga efectele specifice ale consumului de pește sau suplimentarea cu ulei de pește asupra pierderii în greutate la adulții tineri supraponderali (înregistrarea studiului: ClinicalTrials.gov NCT00315770) [18 ]. În acest studiu clinic, au fost incluși un total de 324 de indivizi supraponderali (140 din Islanda, 120 din Spania și 64 din Irlanda) și repartizați aleatoriu în patru grupuri de diete (capsule de control, cod, somon și ulei de pește) [18]. Descrierea detaliată a protocolului, recrutarea și înscrierea participanților, precum și criteriile de includere și excludere sunt descrise în altă parte [18, 19]. Pe scurt, criteriile inițiale de includere au fost indicele de masă corporală (IMC) 27,5-32,5 kg/m 2, vârsta cuprinsă între 20 și 40 de ani și circumferința taliei ≥94 cm și respectiv ≥80 cm pentru bărbați și femei. Criteriile de excludere au fost schimbarea în greutate datorită dietei de slăbit în termen de 3 luni înainte de începerea studiului, utilizarea suplimentelor care conțin -3 acizi grași, calciu sau vitamina D în ultimele 3 luni, tratamente medicamentoase pentru diabetul zaharat, hipertensiune arterială sau hiperlipidemie și sarcina sau alăptarea femeilor.

). Pentru a reduce variabilitatea, subiecții aparținând grupurilor de cod și somon nu au fost analizați, deoarece dacă s-ar observa modificări ale metilării ADN în aceste grupuri, ar fi imposibil să se găsească agenții responsabili din cauza diferențelor mari de macronutrienți și micronutrienți dintre ambele specii de pești. Studiul a fost aprobat de Comitetul Etic al Universității din Navarra și a urmat liniile directoare de la Helsinki. Toți participanții și-au dat consimțământul în scris după ce au fost informați despre scopul naturii și posibilele riscuri ale studiului. Acest studiu a fost efectuat la Universitatea din Navarra din Pamplona, ​​Spania, iar recrutarea a fost efectuată în 2004 și 2005.

model

2.2. Intervenție dietetică
2.3. Măsurători antropometrice și metabolice

Măsurătorile parametrilor antropometrici și colectarea probelor de sânge au fost efectuate la momentul inițial și după perioada de suplimentare (punct final), așa cum s-a descris anterior [24]. Nivelurile plasmatice de glucoză, colesterol total și triacilgliceroli au fost măsurate prin teste colorimetrice specifice (Horiba ABX Diagnostics, Montpellier, Franța) utilizând un sistem automat (COBAS MIRA, Roche, Basel, Elveția), în timp ce nivelurile de insulină circulante au fost determinate de ELISA, AB, Uppsala, Suedia). Indicele de evaluare a modelului de homeostazie (HOMA-IR) a fost calculat conform lui Matthews și colab. [25] pentru a evalua rezistența la insulină.

2.4. Izolarea PBMC, extracția ADN și conversia bisulfitului

PBMC-urile au fost izolate prin centrifugare diferențială folosind Polymorphprep (Axis Shield PoC AS, Oslo, Norvegia), așa cum s-a descris anterior [26], și stocate la -80 ° C. ADN-ul a fost extras folosind Mini-Kit AllPrep ADN/ARN (Qiagen, Hilden, Germania). Concentrația ADN-ului a fost cuantificată cu kitul de analiză Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) și ADN genomic (2 μg) a fost transformat în bisulfit cu trusa de bisulfit EpiTect (Qiagen, Valencia, CA, SUA).

2.5. Profil de metilare determinat prin spectrometrie de masă MALDI-TOF

Profilurile de metilare a ADN-ului a cinci gene au fost analizate în PBMC: CD36, CD14, FADS1, PDK4, și FFAR3. Secvențele genomice studiate sunt prezentate în Tabelul 1S în materiale suplimentare disponibile online la http://dx.doi.org/10.1155/2014/675021.

În primul rând, a fost aleasă o regiune care acoperă 3 kb (2.000 de perechi de baze în amonte până la 1.000 de perechi de baze în aval de locul de pornire transcripțional) de la Gene Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) pentru fiecare genă. Insulele CpG au fost identificate utilizând software-ul MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/) [27]. În timp ce trei gene au arătat insulele CpG (CD14, PDK4, și FADS1), nici unul FFAR3 nici CD36 au arătat aceste regiuni bogate în dinucleotide CpG. Site-urile de legare a factorului de transcripție prevăzute au fost identificate cu software-ul AliBaba2 (http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html) cu o omologie de 75%. Apoi, a fost aleasă o regiune de 300 până la 500 pb într-o insulă CpG și/sau bogată în factori de transcripție preziși pentru fiecare genă (Tabelul 1). Profilul de metilare al acestor gene a fost determinat de tehnologia MassARRAY EpiTyper de la Sequenom (Sequenom, San Diego, CA, SUA), care se bazează pe scindarea specifică bazei urmată de spectrometria de masă MALDI-TOF așa cum s-a descris anterior [28]. Primerii utilizați sunt raportați în Tabelul 1. Valorile metilării ADN-ului unor site-uri CpG nu au putut fi măsurate independent. Acesta este cazul siturilor CpG din apropiere și a siturilor CpG incluse în fragmente chimice similare după defalcarea enzimatică. Deci, au fost grupați împreună și au fost considerați ca un site CpG independent atunci când au fost analizați.