Mesele de la prânz nu afectează memoria șoarecilor Rapoarte științifice
Subiecte
Abstract
Introducere
Șobolanii și șoarecii nocturni cu acces gratuit la alimente sunt activi și mănâncă predominant noaptea, sub controlul unui stimulator cardiac circular-luminos-întunecat (LD) în nucleul suprachiasmatic (SCN). Dacă disponibilitatea alimentelor este limitată la jumătatea perioadei de lumină timp de o săptămână sau mai mult, apare o perioadă de activitate în așteptarea mesei zilnice 1,2,3, iar ceasurile circadiene din majoritatea organelor și țesuturilor periferice se schimbă pentru a se alinia la ora mesei 4, 5. Aceste ajustări circadiene la programele zilnice de hrănire nu implică stimulatorul cardiac SCN, deoarece SCN, atunci când este antrenat la ciclurile LD, nu este deplasat prin hrănirea diurnă 6,7,8, iar ablația SCN nu perturbă ritmurile anticipative ale alimentelor sau împiedică antrenarea perifericelor ceasuri la hrănirea programată 9,10,11 .
Metode
Animale și locuințe
Șoareci C57BL/6 masculi tineri (N = 110, vârsta de 2-4 luni) au fost obținuți de la Charles River (QC, Canada). Cohorte separate au fost utilizate pentru a testa NOR într-un labirint Y (Experiment 1, N = 34) și într-un câmp deschis (Experiment 2, N = 37). O a treia cohortă (N = 40) a fost utilizată pentru a testa alternanța spontană (Experimentul 3a) și condiționarea contextuală a fricii (Experimentul 3b). Toți șoarecii au fost adăpostiți într-un singur ciclu LD 12:12 (LED alb,
15 lux la fundul cuștii) cu alimente și apă disponibile ad libitum timp de cel puțin două săptămâni înainte de hrănirea restricționată. Temperatura camerei a fost menținută la
22 ° C. În Experimentul 1, activitatea locomotorie a fost înregistrată continuu utilizând software-ul de achiziție și analiză de date Clocklab (Actimetrics, SUA). Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor al Universității Simon Fraser (Protocolul 1208P-16) și toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările relevante.
Alimentare restricționată
Șoarecii din experimentul 1 (testul Y-labirint) au fost menținuți pe un program de hrănire restricționat timp de cel puțin 40 de zile înainte de testare pentru a asigura o antrenare stabilă la programul de hrănire. Programul a fost inițiat cu o lipsă de hrană de 18 ore începând cu Zeitgeber Time (ZT) 12 (unde ZT0 este aprins, prin convenție). Mâncarea a fost apoi pusă la dispoziție în fiecare zi la ZT3 (3 ore după aprinderea luminii; alimentarea cu ziua) sau ZT15 (la 3 ore după aprinderea luminii; alimentarea pe timp de noapte). Durata mesei a fost de 10 ore în prima zi, redusă cu 1 oră/zi pentru următoarele patru zile și menținută la 6 ore (ZT3-9 sau ZT15-21) până la sfârșitul testului NOR. Alimentele consumate și greutățile corporale au fost măsurate zilnic în primele 2 săptămâni.
Șoarecii din Experimentul 2 (test de câmp deschis NOR) și Experimentul 3 (alternanță spontană și teste contextuale de condiționare a fricii) au fost menținuți în programul de hrănire restricționat, așa cum este descris de Loh și colab. 12. În consecință, șoarecii au fost lipsiți de alimente timp de 24 de ore și apoi au furnizat alimente timp de 6 ore pe zi de la ZT3-9 sau ZT15-21 timp de 2 săptămâni, procedurile de testare începând în ziua 15 de hrănire restricționată.
Cronologiile și aparatele experimentelor pentru fiecare experiment sunt ilustrate în figura suplimentară S1.
Experimentul 1: test NOR în aparatul cu labirint Y
Labirintul Y are avantaje față de câmpul deschis pentru testarea memoriei obiectelor. Brațele înguste ale labirintului Y reduc anxietatea și, prin urmare, încurajează explorarea. Pereții înalți limitează utilizarea reperelor spațiale, încurajând atenția asupra obiectelor. Labirintul Y a fost realizat din Perspex alb opac omogen (descris în 24). Pereții aveau 30 cm înălțime și fiecare braț avea 16 cm lungime și 8 cm lățime. O cameră video digitală a fost montată deasupra labirintului pentru a înregistra toate încercările. Un braț a fost folosit ca braț de pornire, iar celelalte două brațe au fost folosite pentru a prezenta obiectele fixate pe podeaua labirintului folosind Blu-tack ™. Labirintul și obiectele au fost șterse cu o soluție de etanol 50% și uscate între probe. Obiectele folosite și partea laterală a labirintului în care a fost prezentat noul obiect au fost contrabalansate. Toate testele în labirintul Y au fost efectuate sub lumină slabă (alb incandescent,
Șoarecii au fost obișnuiți cu o manipulare ușoară timp de 3-4 minute, sesiuni de manipulare repetate zilnic
Cu 2 săptămâni înainte de testarea NOR. Șoarecii au fost obișnuiți cu labirintul Y prin plasarea în aparat timp de 10 minute în fiecare din cele două zile imediat anterioare primului test NOR. Fiecare test NOR a constat din două teste de familiarizare și un test de alegere, programate la intervale de 24 de ore în zile succesive. În timpul studiilor de familiarizare, șoarecii au fost așezați într-un capăt al labirintului Y cu două obiecte identice la celelalte două capete și au fost lăsați să exploreze timp de 5 minute. În timpul procesului de alegere, șoarecii au fost plasați în labirintul Y și au fost prezentați cu unul familiar obiect, care era identic cu obiectele prezentate în faza de familiarizare, și unul roman obiect, pe care șoarecii nu l-au mai întâlnit anterior. Șoarecii au primit 5 minute pentru a explora labirintul și obiectele. Șoarecii au fost apoi returnați în cuștile de acasă și au fost menținuți în programele de hrănire restricționate pentru încă 4 zile. Secvența de testare de 3 zile a fost apoi repetată la un alt moment al zilei și secvența completă de 7 zile a fost repetată până când fiecare șoarece a fost testat în toate cele patru puncte de timp (ZT3, 9, 15 și 21, contrabalansat pentru comandă).
Nivelurile de activitate exploratorie sunt afectate de foame. Prin urmare, în timpul celor 24 de ore anterioare fiecărui studiu de alegere, șoarecilor li s-a oferit o masă mică (25% din consumul mediu zilnic de alimente) la fiecare 6 ore (ZT3, 9, 15 și 21), în locul unei mese mari la ZT3 sau ZT15. Acest lucru a asigurat că timpul de la hrănirea durabilă a fost echivalent la fiecare test de alegere.
Experimentul 2: test NOR în aparate în câmp deschis
Procedurile utilizate în experimentul 2 au fost destinate să se potrivească cu cele ale lui Loh și colab. 12 cât mai aproape posibil. În consecință, testarea a fost efectuată în cutii albe opace (55 × 37 × 33 cm). Obiectele (din Experimentul 1) au fost plasate central, la distanță una de cealaltă și de laturile câmpului deschis. Testarea la ZT9 a fost efectuată în lumină (
30 lux) și testarea la ZT21 sub lumină roșie slabă (0,5 reprezintă o preferință de noutate.
Extracția hipocampului și reacția în lanț cantitativă a polimerazei
Ritmurile circadiene sunt conduse de bucle de feedback de transcriere-traducere autoreglare care implică un grup de gene de ceas care include Bmal1 și Per2 25. Genele ceasului sunt responsabile pentru oscilațiile circadiene la nivel celular și expresia poate fi utilizată pentru a evalua faza circadiană specifică țesutului. În ziua următoare testului NOR și a ultimei mese programate, șoarecii hrăniți pe timp de zi și hrăniți în noapte în Experimentul 2 au fost eutanasiați prin CO2 la ZT3, 6, 9 sau 15, fără să se hrănească în acea zi. Șoarecii au fost decapitați și creierele au fost extrase și răcite rapid în soluția de sare echilibrată de Hank (HBSS; Millipore-Sigma H1641, St Louis, MO) suplimentată cu tampon Hepes (Millipore-Sigma H0887, St Louis, MO) și NaCHO3 Millipore -Sigma S8761, St. Louis, MO). Creierele au fost menținute în secțiuni HBSS la 4 ° C și secțiuni de 1100 microni începând cu
1,58 mm posterioare de bregma 26 au fost secționate pe un vibratom. Hipocampul dorsal a fost separat folosind un bisturiu și plasat imediat într-un tub Eppendorf de 2 ml și congelat rapid pe gheață uscată. Țesutul a fost menținut la -80 ° C până la izolarea ARN. ARN-ul a fost izolat folosind reactivul Trizol (Thermo Fisher Scientific, 15596018, Waltham, MA) conform instrucțiunilor producătorului și concentrațiile au fost cuantificate folosind un spectrometru. ARN (500 ng) a fost transcris invers către ADNc utilizând trusa de transcripție inversă a ADNc de mare capacitate (Thermo Fisher Scientific, 4368814, Waltham, MA). Reacția în lanț cantitativă a polimerazei (qPCR) a Per2 a fost realizat folosind 2 μL de ADNc cu SYBR Green FastMix (Quanta Biosciences, 95073, Gaithersburg, MD) într-un sistem StepOnePlus PCR în timp real (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). expresie mARN a Per2 și Bmal1 a fost normalizat la Rplp0. Grundele utilizate sunt furnizate în tabelul suplimentar S1.