Malnutriția maternă afectează morfologia și transportul placentar

Abstract

Introducere

Placenta este un participant activ la sarcină, acționând ca o conductă între mamă și făt. În această capacitate, poate promova creșterea fetală prin transferul de nutrienți și oxigen 1-3 și reduce la minimum expunerile adverse la atingerea fătului prin intermediul transportorilor de eflux și a altor sisteme de barieră 4. Atunci când funcția sa este optimă, placenta se poate adapta la schimbările din mediul sarcinii și poate amortiza fătul de expuneri adverse 1.5. Dar dacă capacitatea placentei de a răspunde la stimulii de mediu este compromisă, probabil din cauza dezvoltării și/sau funcției placentare modificate, adaptarea poate fi insuficientă sau absentă, iar creșterea și dezvoltarea fetală pot fi afectate negativ 1.5. Creșterea slabă a fătului este problematică: este asociată cu traiectorii de creștere suboptimă în viața timpurie și cu un risc crescut de boli cronice pe termen lung 6.7. Cu toate acestea, rămâne neclar modul în care placenta se adaptează la mediile de sarcină modificate într-un mod care ar putea modela creșterea fetală și ar putea sta la baza originilor timpurii ale bolii ulterioare.

morfologia

Nu toți fetușii expuși la medii adverse în uter prezintă semne de creștere compromisă, care pot fi explicate prin capacitatea de adaptare a placentei, influențând capacitatea sa de a acționa ca o barieră selectivă pentru factorii trofici și alte xenobiotice. Am emis ipoteza că placenta s-ar putea adapta diferit la dietele materne ONU și HF, prin schimbări în dezvoltarea și funcția acesteia, iar aceste adaptări ar explica de ce descendenții mamelor ONU și HF cresc diferit în uter și ar putea dezvălui mecanisme care stau la baza originilor dezvoltării bolii ulterioare. . Pentru a aborda acest lucru, am evaluat markeri selectivi de dezvoltare placentară și transportatorii ABC și de acizi grași la sfârșitul sarcinii la barajele hrănite cu o dietă normală, ONU sau hrănite cu o dietă IC, și am determinat efectele acestor diete asupra metabolismului matern și a creșterii fetale.

Metode

Model animal

Colectarea și prelucrarea biospecimenului

La GD18.5, perioada de vârf a creșterii fetale și imediat după atingerea volumului placentar maxim, a spațiului sanguin matern și a dezvoltării capilare fetale 51, barajele au fost ucise prin luxația cervicală. Imediat după aceea, glucoza din coadă a fost măsurată folosind un glucometru comercial (Roche Accucheck). Barajele au fost decapitate și sângele din trunchi a fost colectat în tuburi acoperite cu heparină pentru a izola plasma. Feturile și placentele au fost disecate rapid din uter și cântărite, iar țesuturile au fost congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80C, pentru analize moleculare ulterioare, sau clătite cu PBS 1X rece ca gheața, apoi fixate în formalină 10% tamponată neutră, urmat de depozitare în 70% EtOH la 4 ° C înainte de a fi încorporat în parafină pentru analize histologice ulterioare.

Analize histologice

5 secțiuni placentare încorporate în parafină param au fost colorate conform protocoalelor standard cu hematoxilină și eozină Y (H&E), acid periodic - Schiff (PAS) sau cu anticorpi specifici primari și secundari, așa cum este descris mai jos. Diapozitivele colorate cu H&E și PAS au fost scanate digital la o mărire de 5x sau respectiv de 20x, folosind un scaner digital de diapozitive Hamamatsu la Facilitatea de imagistică optică a Institutului de cercetare Lunenfeld-Tanenbaum. Imaginile rezultate au fost vizualizate folosind ImageJ și pluginurile ImageJ NDPITools 52. Măsurătorile zonelor de joncțiune placentară și zone labirintice au fost calculate așa cum a fost descris de Bloise și colab. 53 (2012). Celulele PAS-pozitive au fost numărate în întreaga secțiune placentară și exprimate ca număr de celule PAS-pozitive/zona spongiotrofoblastului sau/zona JZ. Scorarea analizei zonei placentare și a imaginii a fost efectuată pe un placent de sex masculin și unul de sex feminin din fiecare grup dietetic, unde fiecare probă selectată a reprezentat greutatea medie fetală și placentară pentru acel grup de dietă 53,54. Un observator orbit de grupurile experimentale a efectuat analiza imaginii.

Placentae au fost colorate pentru P-gp (1: 500, D-11 Santa Cruz, Mississauga, Canada) și BCRP (1: 200, Calbiochem, Etobicoke, ON, Canada) așa cum este descris mai sus, cu următoarele modificări: secțiunile au fost stinse folosind 0,03 % peroxid de hidrogen în 1X PBS timp de 30 de minute la temperatura camerei; anticorpul secundar a fost anticorp anti-șoarece biotinilat de capră (1: 200, Vector Labs); și timpul de incubație a substratului DAB peroxidazei pentru a vizualiza semnalele anticorpilor a fost de 30 de secunde atât pentru P-gp cât și pentru BCRP. Din secțiuni colorate, șase imagini au fost capturate aleatoriu la o mărire de 20X (microscop inversat Leica DMIL LED și software QCapture Pro) în spongiotrofoblast și în zonele labirintului. Analiza semicantitativă pentru a obține intensitatea colorării în fiecare imagine a fost realizată de un singur observator orbit de grupurile experimentale așa cum s-a descris anterior 55. Colorarea a fost marcată ca absentă (0), slabă (1), moderată (2), puternică (3) și foarte puternică (4). A fost calculată intensitatea medie a colorării în cele șase imagini pentru fiecare zonă placentară pentru fiecare placentă.

hibridizare in situ

Arhitectura placentară la GD18.5 a fost analizată utilizând programul software Visiopharm NewCAST (Horsholm, Danemarca) în urma hibridizării in situ utilizând următoarele sonde: Ctsq, Prl3b1, Pcdh12 și Tpbpa așa cum s-a descris anterior 19. 20% din suprafața per secțiune placentară a fost numărată aleatoriu la o mărire de 20x (folosind un microscop Olympus BX61) cu 20 de puncte pe câmp vizual, reprezentând 8,9 mm 2 per punct/număr. Un total de 3 sau 4 secțiuni pe placentă au fost analizate din 4 placente de sex feminin și 4 bărbați pe grup dietetic. Suprafețele totale sau relative pentru structuri specifice au fost calculate pentru fiecare secțiune și mediată pe placentă. Structurile de interes au inclus celulele glicogenului, celulele PAS-pozitive, TGC sinusoidale, TGC, celulele glicogen interstițiale, spațiul sanguin matern, spațiul sanguin fetal, spațiul sanguin matern în SW, zona trofoblastului labirintic și zona spongiotrofoblastului. Mărimea SW a fost calculată prin însumarea zonelor sinusale spongiotrofoblast, TGC și SW. Mărimea LZ a fost calculată prin însumarea spațiului sanguin fetal, a sinusului labirintic și a zonelor trofoblastice labirintice.

Măsurători ale biomarkerului plasmatic

Testele de plăci specifice șoarecilor disponibile în comerț au fost utilizate conform instrucțiunilor producătorului pentru a măsura biomarkerii în circulația maternă. Insulina plasmatică (șoarece ultrasunet ELISA, ALPCO, Salem, NH, SUA), leptina (șoarece ELISA, Crystal Chem, Downers Grove, IL, SUA), adiponectină (șoarece ELISA cu greutate moleculară mare, ALPCO, Salem, NH, SUA) și trigliceridele (LabAssay Triglyceride Kit, Wako, Richmond, VA, SUA) au fost măsurate în plasmă. Acizii grași liberi (kitul gratuit de cuantificare a acizilor grași, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) au fost măsurați în eritrocite materne grupate pentru fiecare grup dietetic datorită volumului redus de eritrocite disponibile de la fiecare animal, ceea ce face imposibilă măsurile individuale ale animalelor.

Izolarea și exprimarea ARNm în placentă

ARN-ul total a fost extras din placenta 29 folosind reactivul TRIZOL (Invitrogen) urmând instrucțiunile producătorului. Puritatea și concentrația ARN au fost evaluate prin analiză spectrofotometrică (Nanodrop) și integritatea ARN a fost verificată utilizând electroforeza pe gel. 1 Rg ARN a fost transcris invers utilizând 5X iScript Reverse Transcription Supermix (BioRad, Mississauga, ON, Canada). O probă de transcripție non-inversă (NRT; absența enzimei) a fost transcrisă invers pentru a oferi un control negativ pentru reacția RT în aplicațiile PCR din aval.