Lipoliza mezenterică a grăsimilor mediază steatoza hepatică asociată cu obezitatea și rezistența la insulină

Abstract

Studii de prindere a glucozei

Studiile de fixare a glucozei au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (23). Clemele au fost efectuate la șoareci în mișcare liberă. GIR a fost calculat odată ce perfuzia de glucoză a atins o rată mai mult sau mai puțin constantă, cu niveluri de glucoză din sânge la 5 mmol/L (80-90 min după începerea perfuziei cu insulină). Ulterior, nivelul glicemiei a fost menținut constant la 5 mmol/L timp de 15-20 min, iar GIR a fost calculat. Rata de eliminare a glucozei a fost calculată prin împărțirea ratei perfuziei [3-3 H] glucoză la activitatea specifică glucozei plasmatice [3-3 H] (24,25). Producția endogenă de glucoză (EGP) în timpul clemei a fost calculată prin scăderea GIR din rata de eliminare a glucozei (24,25). Pentru a evalua absorbția de glucoză specifică țesutului, un bolus (10 μCi) de 2- [1-14 C] deoxiglucoză a fost administrat printr-un cateter la sfârșitul perioadei de echilibru. Sângele a fost prelevat la 2, 15, 25 și 35 de minute după nașterea bolusului. Zona de sub curba de dispariție a 2- [1-14 C] deoxiglucoză a fost utilizată împreună cu concentrația tisulară de 2- [1-14C] dezoxiglucoză fosforilată pentru a calcula absorbția glucozei.

lipoliza

Analize de lipoliză

Adipocitele au fost izolate și lipoliza evaluată așa cum s-a descris anterior (26). Adipocitele izolate au fost incubate în absența sau prezența a 100 nmol/L insulină, 100 ng/mL recombinant IL-6 murin (Sisteme R&D) sau 1 μmol/L izoproterenol (Sigma, Buchs, Elveția) timp de 1 oră. Nivelurile FFA au fost măsurate utilizând metoda ACS-ACOD-MEHA (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germania).

Determinarea dimensiunii celulei

Mărimea celulei adipocitelor izolate a fost analizată de un contor de colier Multisizer 3 așa cum s-a descris anterior (27).

Prelevarea de sânge

Cavitatea abdominală a șoarecelui a fost deschisă imediat după moarte, iar vena portală a fost expusă. Vena portală a fost perforată de o seringă (0,30 mm [30G] × 8 mm; BD, Franklin Lakes, NJ) și sângele a fost colectat. Sângele sistemic a fost prelevat după puncție cardiacă folosind seringi similare. S-a adăugat sânge într-un tub Eppendorf cu o concentrație finală de 5 mmol/L EDTA. După centrifugare, plasma a fost depozitată la -80 ° C până la prelucrarea ulterioară.

Determinarea nivelurilor de insulină plasmatică, trigliceride și FFA

Nivelurile trigliceridelor plasmatice (TG) și ale FFA au fost determinate așa cum s-a descris în altă parte (28). Nivelurile de insulină plasmatică au fost măsurate folosind un kit ELISA așa cum s-a descris anterior (29).

Western Blotting

Probele de ficat sau AT au fost omogenizate și Western blot s-a efectuat așa cum s-a descris anterior (30). Au fost utilizați următorii anticorpi primari: anti-gp130 și anti-supresor al citokinei de semnalizare 3 (SOCS3) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX); anti-phosphop38, anti-phosphoERK și anti-ERK (Cell Signaling, Danvers, MA); și anti-actină (Millipore, Billerica, MA). Membranele au fost analizate cu ajutorul unui analizor luminescent de imagine care rulează software-ul Image Reader (FujiFilm, Dielsdorf, Elveția).

Extracția ARN și RT-PCR cantitativă

ARN-ul total a fost extras folosind un mini kit RNeasy Lipid Tissue (QIAGEN, Basel, Elveția), iar concentrația a fost determinată spectrofotometric (NanoDrop 1000; NanoDrop Instruments, Boston, MA). O microgramă de ARN a fost transcrisă invers cu SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Basel, Elveția) folosind un primer hexamer aleatoriu (Invitrogen). TaqMan (Applied Biosystems, Rotkreuz, Elveția) a fost utilizat pentru amplificarea PCR în timp real. Au fost utilizați următorii primer PCR (Applied Biosystems): factor de necroză tumorală-α (TNF-α), Mm00443258_m1; IL-6, Mm00446190_m1; F4/80, Mm00802529_m1; CD11b, Mm00434455_m1; acizi grași sintaza (FAS), Mm00662319_m1; proliferator de peroxizomi - receptor activat-α (PPARα), Mm00627559_m1; SREBP1, Mm00550338_m1; SCD-1, Mm01197142_m1; CPT-1, Mm00550438_m1; și AOX, Mm00443579_m1. Expresia genică relativă a fost obținută după normalizare la ARN 18S (Applied Biosystems) folosind ecuația 2 −ΔΔcp (31).

TG hepatic și determinarea lipidelor totale

Țesutul hepatic (20-30 mg) a fost omogenizat în PBS, iar lipidele au fost extrase într-un amestec de cloroform-metanol (2: 1). Lipidele hepatice totale au fost determinate printr-o reacție sulfo-fosfo-vanilină așa cum s-a descris anterior (32). Nivelurile TG hepatice au fost determinate în 50 mg de țesut hepatic conform metodei Bligh și Dyer (33) și cuantificate cu un test enzimatic (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Elveția).

Histologie

Țesuturile hepatice au fost fixate în 4% formalină tamponată și încorporate în parafină. Secțiunile au fost tăiate și colorate cu hematoxilină-eozină.

Analiza datelor

Creșterea în greutate și adipogeneza similare la șoarecii gp130 F/F și gp130 poadipo. A: Analiza Western blot a nivelurilor de proteine ​​gp130 în celulele și țesuturile respective ale șoarecilor gp130 F/F și gp130 ipoadipo. B: Greutatea corporală a șoarecilor hipo-alimentați (●, ●) și HFD (■, ■) gp130 F/F și gp130 iceadipo (n = 5-24). Greutăți de grăsime ale depozitelor epididimale (C) și mezenterice (D) ale șoarecilor padipo gp130 F/F și gp130 hrăniți cu chow și HFD (n = 6-18). Diametrul adipocitelor epididimale (E) și mezenterice (F) ale șoarecilor hipo-alimentați (●, ●) și HFD (■, ■) gp130 F/F și gp130 Δadipo (n = 4-6). Datele sunt medii ± SEM. * P Δadipo; Adipo, adipocite; F/F, gp130 F/F; SkM, mușchi scheletic.