Lactobacillus amylovorus KU4 ameliorează obezitatea indusă de dietă la șoareci prin promovarea rumenirii adipoase
Subiecte
Abstract
Introducere
Se crede că probioticele exercită diferite efecte benefice asupra sănătății umane 8. Noi și alte grupuri am arătat recent că administrarea bacteriilor probiotice la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) promovează oxidarea acizilor grași în țesuturile metabolice, reducând adipozitatea și protejând astfel împotriva obezității induse de dietă și a tulburărilor metabolice asociate acesteia 9,10, 11.12. Acest lucru sugerează că acest efect benefic al bacteriilor probiotice poate fi asociat cu conversia bej a WAT; în consecință, am emis ipoteza că unele probiotice pot promova sau induce rumenirea adipocitelor albe, care, la rândul lor, pot facilita consumul de energie și proteja împotriva obezității induse de dietă. Aici, demonstrăm că administrarea de Lactobacillus amylovorus KU4 (LKU4), o bacterie probiotică, la șoareci hrăniți cu HFD a crescut nivelurile mitocondriale și exprimarea genelor selective BAT în iWAT, cu o creștere concomitentă a temperaturii corpului; în plus, arătăm, de asemenea, că lactatul mediază aceste efecte ale LKU4 asupra rumenirii adipocitelor albe prin remodelarea complexului de transcripție PPARγ prin trecerea RIP140 la PGC-1α, ducând în consecință la protecția împotriva obezității induse de HFD.
Rezultate
Administrarea LKU4 a îmbunătățit obezitatea indusă de HFD
Administrarea LKU4 a promovat un fenotip de tip BAT în iWAT subcutanat la șoareci HFD
LKU4-CM a facilitat rumenirea adipocitelor 3T3-L1
LKU4 a îmbunătățit activitatea PPARγ prin schimbarea raportului PGC-1α la RIP140 asociat cu PPARγ
Lactatul este un metabolit cheie LKU4 care crește expresia genelor importante pentru rumenirea adipocitelor
Pentru a testa în continuare dacă lactatul ar putea media bruna iWAT indusă de LKU4, am comparat mai întâi efectul tratamentelor cu LKU4-CM și lactat asupra expresiei genelor implicate în rumenirea adipocitelor. În concordanță cu rezultatele tratamentului cu LKU4-CM, nivelurile de ARNm de Ucp1, PPARγ, și PGC-1α au fost crescute în adipocite 3T3-L1 după 5 mM tratament cu lactat (Fig. 5C). În schimb, tratamentul cu lactat a scăzut nivelurile de mARN ale RIP140 genă. Așa cum era de așteptat, tratamentul cu lactat a crescut, de asemenea, nivelurile de proteine UCP1, PPARγ și PGC-1α în adipocite 3T3-L1 cu 1,7-, 2,2 și respectiv de 2 ori, comparativ cu adipocitele martor, în timp ce nivelurile de proteine RIP140 au fost reduse cu 60% (Fig. 5D). În plus, eliminarea MCT1 de către ARNsi specifice MCT1 a redus expresia Ucp1 genă de 47
51% dintre cei din adipocite tratate cu LKU4-CM, sugerând că lactatul este esențial pentru rumenirea adipocitelor indusă de LKU4-CM (Informații suplimentare Fig. 3).
Lactatul a facilitat rumenirea adipocitelor 3T3-L1 prin modularea interacțiunii PGC-1α și RIP140 cu PPARγ
Discuţie
Dezechilibrul metabolic datorat aportului ridicat de energie și consumului redus de energie determină obezitate și complicațiile metabolice asociate acestuia 18. Recent, inducerea unui fenotip asemănător adipocitelor maronii în iWAT a fost considerată o abordare terapeutică potențială pentru tratamentul obezității induse de dietă prin promovarea cheltuielilor de energie 5. Aici, am demonstrat că administrarea de LKU4, o bacterie probiotică, la șoareci HFD a dus la creșterea nivelului și activității mitocondriale și a îmbunătățit expresia genelor specifice BAT, cum ar fi Ucp1 și Cidea în iWAT; la rândul său, aceasta a activat rumenirea adipocitelor și a îmbunătățit temperatura corpului, rezultând în protecția împotriva obezității induse de dietă. Conform cu in vivo rezultate, in vitro Tratamentul cu LKU4-CM a provocat același efect asupra biogenezei mitocondriale și asupra expresiei genei BAT, ducând la creșterea OCR-urilor în adipocitele 3T3-L1.
Materiale și metode
Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările relevante.
Experimentarea pe animale
Toate studiile pe animale au fost efectuate conform procedurilor aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Națională Chonnam. C57BL/6 șoareci masculi (în vârstă de 7 săptămâni; greutate, 19 ± 2 g; Damul Science, Daejeon, Coreea) au fost hrăniți fie cu o dietă normală (ND; 16% din totalul caloriilor obținute din grăsimi, Damul Science), fie cu HFD 45 % din totalul caloriilor obținute din grăsimi, Research Diets Inc., New Brunswick, SUA) în cadrul unui ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Celulele LKU4 au fost cultivate în bulion MRS și resuspendate în PBS la
1,0 × 108 cfu/ml și 200 μL din această resuspendare LKU4, sau PBS, au fost administrate pe cale orală zilnic la șoareci timp de 14 săptămâni.
Cultura celulară, transfecția și prepararea LKU4-CM
Imunohistochimie
Pentru analiza histologică, țesuturile au fost fixate cu o soluție de formalină 10% (Sigma-Aldrich, St. Louis, SUA) în PBS (pH 7,4) și apoi încorporate în parafină. După deshidratare în serie, țesuturile secționate au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E). Pentru a evalua dimensiunea adipocitelor, axele lungi și scurte au fost măsurate și mediate. Datele numerice obținute folosind ImageJ sunt prezentate ca mijloace ± S.E.M. Pentru imunohistochimie pe probe de țesut, țesuturile fixate în formalină au fost secționate congelate. Anticorpii anti-UCP1 (SH2436525, 1: 500, Invitrogen, Carlsbad, SUA) și anti-VDAC2 (ab37985, 1: 200, AbCam, Cambridge, Marea Britanie) au fost folosiți ca anticorpi primari. Ca anticorpi secundari s-au folosit anticorpi anti-iepure de capră conjugată Alexa 488 (1: 500) și, respectiv, anticorpi anti-capră de măgar conjugată Alexa 568 (1: 1000). Nucleii au fost contracolorați cu DAPI.
Testele RT-qPCR, ChIP, imunoblot și imunoprecipitare
ARN-ul total extras din celule sau țesuturi cultivate a fost transcris invers în ADNc folosind M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, SUA). Analiza RT-qPCR a fost efectuată așa cum s-a descris anterior 9 și nivelurile de ARN 36B4 au fost utilizate ca control pentru cuantificarea fiecărei gene. Testele ChIP au fost efectuate folosind IgG și anticorpi anti-PPARγ, anti-PGC-1α și anti-RIP140 normali în adipocite 3T3-L1. Secvențele primare pentru PCR sunt enumerate în Tabelul de informații suplimentare 1. Imunoblotarea a fost efectuată folosind anticorpi anti-PPARγ, anti-PGC-1α, anti-RIP140, anti-UCP1 și anti-β-actină, așa cum s-a descris anterior 9. Pentru testele IP, țesuturile și adipocitele 3T3-L1 au fost lizate în tampon RIPA prin rotirea incubării la 4 ° C timp de 20 min. După o scurtă sonicare, lizatele au fost imunoprecipitate folosind anticorpi anti-PPARγ, anti-PGC-1α și anti-RIP140. Imunoprecipitatele au fost ulterior analizate prin imunoblotare.