Interacțiune inhibitoare între neuronii Orexin și alimentație
J. Antonio González
1 Mill Hill Laboratory, Institutul Francis Crick, Londra NW7 1AA, Marea Britanie
Lise T. Jensen
2 Institutul de Medicină Clinică, Universitatea Aarhus, 8200 Aarhus, Danemarca
Panagiota Iordanidou
1 Mill Hill Laboratory, Institutul Francis Crick, Londra NW7 1AA, Marea Britanie
Molly Strom
3 Sainsbury Wellcome Center, University College London, Londra W1T 4JG, Marea Britanie
Lars Fugger
2 Institutul de Medicină Clinică, Universitatea Aarhus, 8200 Aarhus, Danemarca
4 Oxford Center for Neuroinflammation, Division of Clinical Neurology and MRC Human Immunology Unit, Nuffield Department of Clinical Neurosciences, Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford, Oxford OX3 9DS, UK
Denis Burdakov
1 Mill Hill Laboratory, Institutul Francis Crick, Londra NW7 1AA, Marea Britanie
5 Institute of Psychiatry, Psychology and Neuroscience, Department of Developmental Neurobiology, King’s College London, London WC2R 2LS, UK
Date asociate
rezumat
Rezultate si discutii
Dinamica naturală a populației celulelor OH în timpul consumului voluntar
Celulele Orexin/hipocretină (OH) sunt activate de post și de niveluri scăzute de glucoză și au fost formulate ipotezele că conduc alimentația până când glucoza ingerată încet (în câteva minute) le inactivează (Figura 1 A) [19, 24]. Am măsurat activitatea populației de celule OH la șoareci care se comportă liber utilizând fotometria cu fibre [17] a indicatorului de activitate GCaMP6s direcționat către celulele OH în timp ce monitorizați alimentația utilizând urmărirea video sau senzorii tactili (Figura 1 B; Figurile S1 - S3). La șoareci cu comportament liber, am observat fluctuații ale activității în OH-GCaMP6s, dar nu și în celulele OH-eGFP (Figura 1 C). Magnitudinea acestor fluctuații (∼10% –40% ΔF/F) a fost similară cu dinamica rețelei înregistrată cu metode similare în alte regiuni ale creierului [25, 26]. Cuantificarea noastră experimentală a performanței fotometriei a sugerat că> 95% din semnalul de fluorescență ar proveni de la ± 0,5 mm din tipul de fibră (Figurile S2A și S2B), care se potrivește bine dimensiunilor grupului OH din hipotalamusul șoarecelui. Am confirmat că semnalul GCaMP6 reflectă modularea celulelor OH fiziologice prin reproducerea activării in vivo a celulelor OH descrise anterior prin sunete [14] și inhibarea in vitro a celulelor OH de către glucoză [24] (Figurile S1C și S1D). Semnalul OH-GCaMP6s a fost direct proporțional cu viteza de ardere a celulei OH (Figura S3).
Impactul alimentației asupra dinamicii celulare OH naturale in vivo
(A) O ipoteză pentru modularea temporală a celulelor OH în timpul consumului.
(B) Stânga: schema de direcționare a GCaMP6s către celulele OH pentru obținerea datelor prezentate în această figură (datele care utilizează direcționarea alternativă a celulelor OH sunt prezentate în figurile S2C - S2F). Dreapta: localizarea locului de injectare și traseul fibrei optice. 3V, al treilea ventricul; L, D, M, V, lateral, dorsal, medial, ventral; VMH, hipotalamus ventromedial; Arc, nucleu arcuat. Imagine reprezentativă a n = 5 creiere.
(C) Stânga: schemă de înregistrare. Dreapta: urmă de fluorescență în timpul explorării cuștii pentru șoareci care exprimă GCaMP6s sau eGFP în neuroni OH. Exemple tipice de șoareci n = 5 și n = 3, respectiv.
(D) Urmă de fluorescență în timpul introducerii alimentelor în cușcă și consumul ulterior al acesteia (zona umbrită cu portocaliu). Mâncarea era o picătură de milkshake de căpșuni. Exemplu tipic de n = 5 șoareci.
(E) Stânga: urmă de fluorescență în timpul unor accese repetate de contact cu alimentele (zone cu umbră portocalie; mâncarea este un milkshake de căpșuni). Exemplu tipic de n = 5 șoareci. Dreapta: cuantificarea modificării fluorescenței în primele 2 secunde de crize consecutive de contact cu alimentele (înseamnă ± SEM, n = 3 șoareci).
(F) Schimbarea fluorescenței în timpul linsului alimentar detectată cu un senzor tactil (alimentul este un milkshake de căpșuni). Exemplu tipic de n = 5 șoareci din opt alimente prezentat în (H), dreapta.
(G) Sus: densitatea probabilității activității celulei OH. Partea de jos: distribuția diferențelor de bootstrap ale acelorași date. Exemplu tipic de n = 3 șoareci.
(H) Stânga: comploturi peri-eveniment aliniate la debutul loviturilor de lins (linie punctată). Harta de căldură arată lupte individuale (două pe mouse), iar urmele de sub hârtie de căldură arată media mediilor de încercare de la fiecare șoarece (linia roșie; liniile gri reprezintă SEM); n = 5 șoareci. Dreapta: cuantificarea experimentului prezentat în stânga, pentru diferite alimente. Fiecare coloană arată schimbarea fluorescenței în timpul primelor 4 secunde ale unui episod de lins (semnalele medii în timpul 3,5 până la 4 s minus semnal în timpul -0,5 până la 0 s, ori relativ la prima lins). Datele sunt media ± SEM a n = 4 șoareci din fiecare grup. Coloana din stânga este control (șoareci OH-eGFP); alte coloane sunt șoareci OH-GCaMP6s; pentru prescurtări alimentare, consultați Procedurile experimentale suplimentare; repede, peste noapte post înainte de experiment; hrănit, hrănit ad libitum înainte de experiment. Toate modificările la șoarecii OH-GCaMP6 au fost semnificative (p 3.4).
Am constatat că contactul cu alimentele a deprimat activitatea celulelor OH extrem de rapid (Figurile 1 D - 1H). Celulele OH au revenit la o stare ridicată în câteva secunde după ce contactul cu alimentele a fost oprit (Figurile 1 D - 1F; Figura S2E), sugerând că modularea rapidă a celulei OH nu este cauzată de variația lentă a semnalelor nutriționale. Acest efect a fost observat atât la șoarecii OH-GCaMP6s, cât și la cei hrăniți, dar nu și la controalele OH-eGFP (Figura 1 H). Pentru alimentele lichide, scăderea activității celulelor OH a fost evidentă în doar câteva linguri (Figura 1 F; Figurile S2E și S2F). Depresia celulară OH asociată consumului de alimente a fost similară pentru alimentele cu consistență diferită (de exemplu, chow versus iaurt) și cu valoare apetisivă diferită (de exemplu, chow versus unt de arahide) (Figura 1 H). Pentru a confirma dacă conținutul caloric a avut un rol, am testat un „aliment” fără calorii (soluție de sucraloză) și am observat în continuare o inactivare robustă a celulelor OH în timpul linsului (Figura 1 H). În ansamblu, aceste date arată că celulele OH sunt rapid inactivate de actul de a mânca, indiferent de proprietățile alimentelor sau de starea de energie a corpului.
Impactul natural al neuronilor OH asupra alimentației
Datele corelative de mai sus au două interpretări cauzale posibile: (1) celulele OH se opun mâncării și sunt dezactivate pentru a permite să mănânce, sau (2) celulele OH conduc alimentația, astfel încât mâncarea se oprește la scurt timp după ce celulele OH sunt tăcute. Pentru a face distincția între aceste posibilități, am investigat cauzalitatea dintre activitatea OH naturală și alimentația prin inactivarea celulelor OH la șoarecii adulți printr-o strategie de eliminare a celulelor mediată de receptorii toxinei [27, 28].
Am generat șoareci transgenici noi în care expresia receptorului de toxină difterică umană (DTR) este condusă de promotorul OH (vezi Procedurile experimentale suplimentare). La șoarecii OH-DTR, dar nu și la șoarecii WT de control, injectarea toxinei difterice a ablat toate celulele OH, dar nu celulele vecine care conțin hormoni care concentrează melanina, în câteva zile (Figurile 2 A - 2D). Această inactivare completă a celulelor OH, care nu este la fel de ușor de realizat prin metode alternative de reducere a silențierii, cum ar fi opto- și chimiogenetica, poate fi critică pentru elucidarea impactului lor deplin, deoarece fenotipurile de deficiență cheie nu sunt evidente la inactivarea parțială [13].